miRNA-19b 在急性淋巴細胞白血病發病中的作用機制

龍 潺 唐雪元 鄭方英 王春蓮 胡 俊

(惠州市第一人民醫院血液科，廣東 惠州 516000)

?

miRNA-19b 在急性淋巴細胞白血病發病中的作用機制

龍 潺 唐雪元1鄭方英 王春蓮 胡 俊

(惠州市第一人民醫院血液科，廣東 惠州 516000)

目的 探討miRNA-19b對Notch1信號通路的調控作用及miRNA-19b調控下的Notch1信號通路在急性淋巴細胞白血病發病中的作用及機制。方法 Real-time PCR法檢測急性淋巴細胞白血病中miRNA-19b和Notch1信號通路相關分子的表達水平。分別利用miRNA-19b前體片段及miRNA-19b anti-sense片段過表達及干擾miRNA-19b的表達，MTT法檢測miRNA-19b過表達及干擾對急性淋巴細胞白血病患者單個核細胞數量的變化，同時利用Western印跡法檢測miRNA-19b過表達及干擾后Notch1信號通路的激活水平。 結果 (1)急性淋巴細胞白血病中miRNA-19b和Notch1信號通路相關分子Notch1及Hes5的表達水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)。(2)miRNA-19b過表達及干擾后MTT結果顯示miRNA-19b可上調急性淋巴細胞白血病中單個核細胞的數量。(3)Western印跡檢測顯示miRNA-19b過表達可促進Notch1信號通路中Notch1及Hes5的表達，而miRNA-19b干擾后兩分子的表達水平下調。結論 miRNA-19b通過激活Notch1信號通路促進急性淋巴細胞白血病的發病。

miRNA-19b；急性淋巴細胞白血病；Notch1信號通路

在過去的幾十年中，盡管急性淋巴細胞白血病的標準化療已經取得了顯著進展，但是化療藥物的耐藥及治療相關的死亡率仍是治療失敗及效果欠佳的重要原因〔1〕。目前已有大量研究闡明了miRNAs異常表達和腫瘤細胞的增殖、轉移、分化、凋亡、造血、血管生成有關〔2～4〕。同時，miRNAs同樣參與造血系統惡性腫瘤的發病及耐藥，如miRNA-126的過表達與老年急性粒細胞白血病患者的不良預后相關，同時它還參與白血病干細胞的長期維持和自我更新〔5〕。抑制miRNA-21及miRNA-19b可以降低體外白血病細胞集落形成能力及減弱體內的白血病初始細胞活性達到治療白血病的目的。Notch1信號通路不僅可以調控正常組織的生長和發育，其激活水平異常時亦可促進腫瘤的形成。有研究表明，miRNA-19b可參與調控Notch1信號通路的激活水平〔6〕，但是對于miRNA-19b調控下的Notch1信號通路在急性淋巴細胞白血病中的作用目前尚不清楚。本研究旨在探究miRNA-19b對Notch1信號通路的調控作用以及miRNA-19b調控下的Notch1信號通路在急性淋巴細胞白血病中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 病例來源及資料 24例急性淋巴細胞白血病患者選自2011年5月至2016年5月我院血液科，依據骨髓細胞形態學及免疫表型檢查得到確診，且所有入組者均為初治的白血病患者。對照組選擇我院健康體檢門診體檢者20例，所有入組者近期均無感染、出血以及服用免疫抑制劑。收集所有入組者的病例資料及相關信息，抽血前向患者說明實驗目的和研究性質，并簽署患者知情同意書。

1.2 試劑和材料 淋巴細胞分離液購自GE公司。TRIzol購自Thermo公司；M-MLV逆轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；實時熒光定量PCR熒光染料SYBR Green Supermix購自美國BIO-RAD公司；miRNA-19b、Notch1及Hes5、β-actin 擴增引物均由上海杰李公司合成，引物序列見表1。miRNA-19b前體片段、miRNA-19b anti-sense片段及陰性對照片段均購自Ambion公司，且經上海生工公司測序鑒定。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.3 淋巴細胞分選及培養 抽取入組者外周血3～5 ml(肝素抗凝)，利用Hypaque-Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞，操作步驟根據GE公司說明書指示進行。將分離得到的淋巴細胞用RPMI 1640培養基洗滌并制作為細胞懸液(2×107/ml)并培養于RPMI 1640培養液中，培養基中添加20%胎牛血清、100 μg/ml青霉素 、100 μg/ml鏈霉素、2 mol/L谷氨酰胺、1 mol/L丙酮酸鈉，然后提取RNA和蛋白，檢測相關基因的表達水平。

1.4 miRNA-19b在B淋巴細胞中過表達及干擾 在B淋巴細胞中轉染miRNA-19b前體片段、miRNA-19b anti-sense片段及陰性對照片段，作為過表達組、干擾組和對照組。轉染方法按照Life technology公司的Lipo 2000說明書指示。轉染48 h后,提取細胞總RNA進行實時熒光定量PCR檢測miRNA-19b過表達及干擾情況。

1.5 MTT法檢測miRNA-19b表達變化對B淋巴細胞數量的影響 檢測miRNA-19b前體片段、miRNA-19b anti-sense片段轉染后B淋巴細胞數量的變化，參照MTT試劑盒說明書指示進行操作。最后在酶聯免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光值，計算細胞的相對數量。

1.6 Western印跡檢測miRNA-19b對B淋巴細胞中Notch1信號通路的影響 在B淋巴細胞中過表達組及干擾miRNA-19b后,提取細胞總RNA進行Western印跡，檢測Notch1信號通路的改變。Western印跡步驟包括細胞蛋白抽提，蛋白樣品處理，蛋白樣品電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、膠片的壓片檢測、凝膠圖像分析。

2 結 果

2.1 急性淋巴細胞白血病患者miRNA-19b的表達 急性淋巴細胞白血病組單個核細胞中miRNA-19b的表達水平普遍高于對照組(P<0.05)，表明miRNA-19b可能在急性淋巴細胞白血病的發病中具有一定作用。

2.2 急性淋巴細胞白血病中Notch1信號通路的表達 急性淋巴細胞白血病組單個核細胞中Notch1及下游分子Hes5的表達較對照組顯著升高，表明急性淋巴細胞白血病中伴有Notch1信號通路的激活。

2.3 miRNA-19b在B淋巴細胞中過表達及干擾水平

2.4 miRNA-19b過表達及干擾對B淋巴細胞數量的影響 miRNA-19b過表達后細胞活性明顯升高，間接表明B淋巴細胞數量較對照組明顯升高(P<0.05)；而干擾miRNA-19b的表達后B淋巴細胞活性較對照組顯著降低，表明miRNA-19b對B淋巴細胞的活性及數量有一定的調控作用。

2.5 miRNA-19b對B淋巴細胞中Notch1信號通路的影響 在急性淋巴細胞白血病中伴有miRNA-19b和Notch1信號通路相關分子表達的上調。miRNA-19b過表達后Notch1和Hes5的表達升高，而miRNA-19b干擾后上述蛋白水平則顯著下降，與對照組比較有統計學差異(P<0.05)，表明miRNA-19b可激活B淋巴細胞中的Notch1信號通路。見圖1。

圖1 miRNA-19b對B淋巴細胞中Notch1信號通路的影響

3 討 論

MiRNA是一類小的非編碼RNA，能夠通過結合在其mRNA的3'端的UTR區域，負調控靶基因的表達，引起翻譯的抑制及mRNA的降解。已有研究表明miRNA參與造血系統惡性腫瘤的發病及耐藥，如miRNA-320a的過表達與老年急性淋巴細胞白血病患者的不良預后相關〔7〕。抑制miRNA-21及miRNA-196b可以降低體外白血病細胞集落形成能力及減弱體內的白血病初始細胞活性達到治療白血病的目的〔8〕。同時Chen等〔9〕的報道指出CXCR4通過下調LET-7a可以引起急性淋巴細胞白血病化療藥物的耐受性。

miRNA-19b被認為是腫瘤促進因子，可以促進腫瘤的增殖并抑制腫瘤細胞的凋亡〔10〕，在非小細胞性肺癌中miRNA-19b的表達升高，且與腫瘤的病理分級和TNM分期相關〔11〕。在慢性淋巴細胞白血病患者的治療中，表觀遺傳轉錄的沉默導致癌基因轉錄因子PLAG1的過表達可以引起miRNA-19b表達下調，抑制白血病細胞的凋亡〔12〕。愈來愈多的證據指出miRNA-19b可以參與到白血病細胞的增殖遷移中〔13〕。Notch1信號通路是造血微環境中細胞與細胞之間通訊的主要信號通路之一，不僅可以參與到正常組織的生長和發育，在信號通路異常時，可以促進腫瘤的形成。已有研究已經證明，Notch1信號通路的激活可以抑制急性淋巴細胞性白血病的發生〔14,15〕，同時，miRNA-19b可能調控Notch1信號通路相關分子的表達，但是對于miRNA-19b及Notch1信號通路在急性淋巴細胞白血病中機制關聯目前知之甚少，這也是本研究的重點所在。

本結果發現，在急性淋巴細胞白血病患者中miRNA-19b的表達明顯升高，且Notch1及其下游分子Hes5的水平亦顯著升高，表明miRNA-19b和Notch1信號通路可以參與急性淋巴細胞白血病的發病。MTT結果提示miRNA-19b過表達可以上調急性淋巴細胞白血病細胞的數量及活性，而miRNA-19b沉默則結果相反。同時，過表達miRNA-19b后Notch1及其下游分子Hes5的表達水平上調，因此筆者推測在急性淋巴細胞白血病發病中miRNA-19b的誘發作用可能是通過Notch1信號通路實現的，miRNA-19b可能促進了急性淋巴細胞白血病的發生與發展，可以作為急性淋巴細胞白血病藥物研發的重要靶分子。

1 Minervina AA,Komkov AY,Mamedov IZ,etal.Advanced lymphoblastic clones detection in T-cell leukemia〔J〕.Dokl Biochem Biophys,2016;467(1):85-8.

2 Yeh CH,Moles R,Nicot C.Clinical significance of microRNAs in chronic and acute human leukemia 〔J〕.Mol Cancer,2016;15(1):1-16.

3 Dong X,Sui C,Huang K,etal.MicroRNA-223-3p suppresses leukemia inhibitory factor expression and pinopodes formation during embryo implantation in mice 〔J〕.Am J Transl Res,2016;8(2):1155-63.

4 Li Q,Wu Y,Zhang J,etal.MicroRNA-130a regulates cell malignancy by targeting RECK in chronic myeloid leukemia 〔J〕.Am J Transl Res,2016;8(2):955-67.

5 de Carvalho IN,de Freitas RM,Vargas FR.Translating microRNAs into biomarkers:what is new for pediatric cancer〔J〕?Med Oncol,2016;33(5):1-12.

6 Amin NA,Malek SN.Gene mutations in chronic lymphocytic leukemia 〔J〕.Semin Oncol,2016;43(2):215-21.

7 Lu Y,Wu D,Wang J,etal.miR-320a regulates cell proliferation and apoptosis in multiple myeloma by targeting pre-B-cell leukemia transcription factor 3 〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016;473(4):1315-20.

8 Wang JJ,Wang ZY,Chen R,etal.Macrophage-secreted exosomes delivering miRNA-21 inhibitor can regulate BGC-823 cell proliferation〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2015;16(10):4203-9.

9 Zhang W,Sun JZ,Han Y,etal.CXCL12/CXCR4 signaling pathway regulates cochlear development in neonatal mice 〔J〕.Mol Med Rep,2016;13(5):4357-64.

10 Wang J,Song S,Xie C,etal.MicroRNA profiling in the left atrium in patients with non-valvular paroxysmal atrial fibrillation 〔J〕.BMC Cardiovasc Disord,2015;15(5):1-7.

11 Wang XC,Du LQ,Tian LL,etal.Expression and function of miRNA in postoperative radiotherapy sensitive and resistant patients of non-small cell lung cancer 〔J〕.Lung Cancer,2011;72(1):92-9.

12 Patz M,Pallasch CP,Wendtner CM.Critical role of microRNAs in chronic lymphocytic leukemia:overexpression of the oncogene PLAG1 by deregulated miRNAs 〔J〕.Leuk Lymphoma,2010;51(8):1379-81.

13 Landskroner-Eiger S,Qiu C,Perrotta P,etal.Endothelial miR-17 approximately 92 cluster negatively regulates arteriogenesis via miRNA-19 repression of WNT signaling 〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2015;112(41):12812-7.

14 Carofino BL,Ayanga B,Tracey LJ,etal.PRDM14 promotes RAG-dependent Notch1 driver mutations in mouse T-ALL 〔J〕.Biol Open,2016;5(5):645-53.

15 Rasi S,Khiabanian H,Ciardullo C,etal.Clinical impact of small subclones harboring NOTCH1,SF3B1 or BIRC3 mutations in chronic lymphocytic leukemia 〔J〕.Haematologica,2016;52(1):330-9.

〔2016-08-08修回〕

(編輯 曲 莉)

惠州市科技局資助項目(2013Y043)

1 中南大學湘雅三醫院

胡 俊(1968-)，男，主任醫師，主要從事白血病的發病機制研究。

龍 潺(1977-)，女，碩士， 副主任醫師，主要從事白血病的發病機制研究。

R733.7

A

1005-9202(2016)19-4724-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.023