他汀類藥物對心肌缺血再灌注心肌細胞Bax和Bcl-2表達的調控

姚新亮 閆成蕓 張 韓 魯雪麗 萬琪琳

(河南大學淮河醫院心內科，河南 開封 475000)

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他汀類藥物對心肌缺血再灌注心肌細胞Bax和Bcl-2表達的調控

姚新亮 閆成蕓 張 韓 魯雪麗 萬琪琳

(河南大學淮河醫院心內科，河南 開封 475000)

目的 探討他汀類藥物對心肌缺血再灌注心肌細胞基因Bax和Bcl-2的調控作用。方法 選取30只清潔級SD大鼠為研究對象，將該組大鼠用計算機軟件編制的隨機分配表隨機分為三組，假手術組、缺血再灌注組、缺血性再灌注組+阿托伐他汀干預組，每組10只。假手術組每日給予2 ml的0.9%的氯化鈉溶液；治療組每日給予2 ml的0.9%的氯化鈉溶液；干預組為缺血性再灌注組+阿托伐他汀干預組每日給予阿托伐他汀。以上大鼠灌胃3d后制作心肌缺血再灌注模型，模型成功后處死。采用免疫組化測定Bcl-2和Bax蛋白的表達、TUNEL法測定心肌細胞凋亡、RT-PCR檢測Bcl-2和Bax mRNA的表達情況。結果 治療組和干預組大鼠的心肌細胞均呈現不同程度的心肌細胞凋亡現象，AI明顯升高，均高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)。但干預組大鼠的心肌凋亡指數AI低于治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。治療組和干預組的Bcl-2和Bax mRNA的表達以及相關蛋白的表達顯著高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)。但干預組的Bcl-2 mRNA的表達以及相關蛋白的表達顯著高于治療組，Bax mRNA及相關蛋白的表達顯著低于治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 他汀類藥物對心肌缺血再灌注的心肌細胞具有保護作用，其作用機制可能與上調Bcl-2的水平和下調Bax的水平有關。

他汀類藥物；心肌缺血再灌注；心肌細胞；Bax；Bcl-2

心肌缺血再灌注損傷是冠狀動脈搭橋術、冠狀動脈溶栓術以及介入治療中常見的嚴重并發癥，對患者的預后有較大影響〔1〕。他汀類藥物是臨床常用的降脂藥物，此外，還具有免疫調節和影響細胞凋亡的作用；而且阿托伐他汀在心血管保護方面也具有明顯效果〔2〕。但目前，他汀類藥物抵抗心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡的具體機制尚不完全清楚。本研究通過觀察他汀類藥物對心肌缺血再灌注心肌細胞Bax和Bcl-2表達的調控作用，分析他汀類藥物對心肌細胞的保護作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性Sprague-Dauley(SD)大鼠，30只，清潔級，體重(250±20)g，由河南大學實驗動物中心提供，醫學實驗動物環境設施，晝夜明暗交替時間：12 h/12 h。飼料喂養，飲水為自來水瓶裝后高壓滅菌。動物自由采食和飲水；每周換兩次經高壓滅菌的松木刨花墊料。飼養室內每周用0.5%新潔爾滅水溶液噴霧消毒1次。隨機分為假手術組、缺血再灌注組、缺血再灌注+阿托伐他汀干預組，每組10只。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 阿托伐他汀購自輝瑞制藥有限公司，Bax、Bcl-2鼠抗人單克隆抗體和辣根過氧化酶標記的羊抗小鼠IgG抗體購自美國Santa公司。原位末端標記(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司；10%中性甲醛；鏈霉親和素-生物末復合物(SABC)免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒、Fast EvaGreen?qPCR Master Mix購自美國Roche公司；2×PCR Mix 購自西安潤德生物技術有限公司產品。Trizol、dNTPs (10 mmol/L)、隨機引物(25 pmol/μl)、逆轉錄酶、Taq 酶、雙氧水(ddH2O)購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2.2 相關儀器 浙江金華益迪醫療設備廠，輪轉式石蠟切片機；黃石市恒豐醫療器械有限公司，恒溫培養箱；麥克奧迪，BA400光學顯微鏡；成都泰盟科技有限公司，HX-300動物人工呼吸機等。

1.3 模型的制備 假手術組每日給予2 ml 0.9%氯化鈉溶液；缺血再灌注組，每日給予2 ml 0.9%氯化鈉溶液；缺血再灌注+阿托伐他汀干預組每日給予阿托伐他汀(40 mg溶解于10 ml 0.9%NaCl溶液中，灌藥劑量為體重(mg/kg)×70 kg×0.018/200 g)，以上大鼠均灌喂3 d后制作大鼠心肌缺血再灌注模型。制備方法：將大鼠水合氯醛腹腔麻醉(10 ml/kg)，仰臥位固定于手術臺上，接心電監護儀監測心電變化，用針形電極插入大鼠四肢皮下記錄Ⅱ導聯心電圖。頸部正中切口，氣管插管，接人工呼吸機(頻率55次/min，潮氣量1.5 ml/100 g，自左側3～4肋間開胸，暴露心臟，于冠狀動脈左前降支起始0.2 cm處穿線(以0號線結扎左冠狀動脈前降支)。待呼吸、血壓平穩15 min后，在結扎線與血管之間穿一直徑2 mm、長5 mm的硅膠管。30 min后剪斷絲線使血流再通，取出硅膠管。灌注120 min(假手術組僅穿線不結扎)，同步觀察肢體導聯心電圖、頸動脈血壓。之后處死動物，取出心臟。結扎成功標志：結扎線遠端左心室前壁心肌顏色發紺，同步心電圖Ⅱ導聯表現為ST段抬高或R波高聳。制模成功標志：松開結扎線以恢復冠狀動脈血量，左心室前壁由發紺逐漸紅潤，抬高的ST段下降二分之一〔3〕。

1.4 相關檢測指標及方法

1.4.1 免疫組化測定Bcl-2和Bax蛋白的表達 將剪下的缺血區心肌經4%甲醛固定48 h后(pH7.4)，將組織修塊，采用石蠟包埋，標本經4 μm連續切片，室溫放置30 min后，切片常規二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，消除內源性過氧化物酶的活性。一部分用于TUNEL法檢測凋亡細胞；一部分用于免疫組化染色；一部分用于免疫組化檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達情況。嚴格按照試劑盒的操作說明進行。用已知心臟組織陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。免疫組化的結果判定：光學顯微鏡下觀察，隨機選擇10個具有代表意義的高倍視野，每個視野計數 100 個細胞的陽性表達細胞數，判斷表達程度。Bax定位于細胞質內，Bcl-2定位于細胞質或細胞核。陽性細胞染色呈棕黃色或棕褐色。免疫陽性率=免疫細胞陽性數/(免疫細胞陽性數+免疫細胞陰性數)×100%。

1.4.2 RT-PCR檢測Bcl-2和Bax mRNA 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-Time PCR)檢測，按照RNA fast200說明書進行實驗操作。首先采用Total RNA提取液提取總RNA，按照TAKARA試劑盒將總 RNA逆轉成cDNA并保存于-20℃冰箱，采用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，主要步驟有勻漿、分相、沉淀、清洗、溶解、RNA濃度測定，然后制備反應液，按 Fermentas 逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄反應、Real-Time PCR反應(共35個循環)，PCR產物經2%瓊脂糖凝膠(含0.5%溴乙啶)電泳分離，以β-actin作為內參照，反應結束后確認Real-Time PCR的擴增曲線和熔解曲線，制作標準曲線。用ABI7500 FAST型熒光定量PCR儀檢測，實驗重復3次。PCR引物序列采用primer express2.0軟件嚴格按照相關原則設計。

1.4.3 心肌細胞凋亡的檢測 將制備好的組織切片采用TUNEL試劑盒說明書進行標記染色，光學顯微鏡下觀察。凋亡細胞質呈棕黃色，正常細胞質呈藍色。高倍鏡下每張切片隨機選取10個視野，分別計算每個視野的凋亡細胞核細胞總數，凋亡指數(AI)=視野內凋亡細胞個數/視野內所有心肌細胞個數×100%，將以上10個視野的AI取平均值。

1.5 統計學方法 應用SPSS15.0軟件，計數資料多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 各組Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表達 心肌缺血再灌注組和阿托伐他汀組的Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表達顯著高于假手術組(P<0.05)。但阿托伐他汀組的Bcl-2 蛋白及mRNAGE DP 顯著高于缺血再灌注組，Bax蛋白及mNRA表達顯著低于缺血再灌注組(P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠Bcl-2和Bax 蛋白表達比較

與假手術組相比:1)P<0.05；與缺血再灌注組相比:2)P<0.05；下表同

2.2 心肌細胞凋亡的檢測情況 缺血再灌注組和阿托伐他汀組大鼠的心肌細胞均呈現不同程度的心肌細胞凋亡現象，AI明顯升高〔(34.87±2.39)%、(20.82±1.95)%〕，均高于假手術組〔(4.39±1.84)%〕(P<0.05)。但阿托伐他汀組大鼠的心肌AI低于缺血再灌注組(P<0.05)。高倍鏡下觀察心肌缺血再灌注后凋亡細胞數明顯增加(棕色)，缺血再灌注組顯現大量的凋亡細胞，阿托伐他汀組較缺血再灌組凋亡細胞數明顯下降，僅見少數散在的凋亡細胞。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌細胞凋亡情況

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是指缺血的心肌組織恢復血供時，導致再灌注區心肌細胞及局部血管網顯著的病理生理變化〔4〕。心肌缺血再灌注不僅能夠導致細胞壞死，還能誘導細胞凋亡。心肌細胞凋亡是引起心室重塑、心律失常以及心功能不全的重要原因。因此，減少心肌細胞凋亡有助于改善心肌缺血再灌注損傷的預后。近年來，有研究發現采用藥物預處理能夠有效抑制心肌缺血再灌注的心肌細胞凋亡，減少心肌梗死面積〔5〕。孟紅等〔6〕報道，短期的阿托伐他汀能夠清除缺血再灌注損傷大鼠的自由基，干預Fas蛋白表達，減少心肌細胞凋亡。孫曉靖等〔7〕研究顯示，阿托伐他汀能夠減輕急性損傷大鼠的心肌細胞凋亡，改善左室重塑，機制與促進Bax/Bcl-2趨于平衡有關。

本研究提示阿托伐他汀有抑制心肌細胞凋亡的作用，與上述學者的研究結果基本一致。心肌缺血再灌注損傷受眾多因素的影響，其中一個重要的作用機制就是細胞凋亡。細胞凋亡受到細胞內促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的調控，當兩種蛋白比例失衡時容易引發細胞凋亡〔8〕。Bcl-2蛋白發揮抑制細胞凋亡的作用，Bax表達水平增高時促進細胞凋亡，細胞內Bax/Bcl-2比值決定細胞是生存還是凋亡。本研究結果顯示，心肌缺血再灌注大鼠，Bax/Bcl-2比值上升，因此表現為細胞凋亡明顯增多。

通過藥物干預凋亡相關基因的表達，調控細胞內信號傳導途徑，以減少細胞凋亡，可能會成為治療心血管疾病的重要途徑〔9〕。經過阿托伐他汀干預后，對抗細胞凋亡的機制可能與上調Bcl-2水平和下調Bax水平有關。高鳳敏等〔10〕研究顯示，阿托伐他汀預處理能夠抑制缺血再灌注大鼠的脂質過氧化損傷，增強抗氧化酶的活性，減少心肌細胞凋亡，認為這種心肌保護作用與抑制了半胱氨酸蛋白酶(Caspases)-3和Caspases-8蛋白的表達、提高NF-κB表達有關。由此可見，阿托伐他汀對抗心肌凋亡的機制是多方面的，在下一步的實驗中筆者還將展開更深入的研究。

1 關 鍵，孫 妍，孫筱璐，等.阿托伐他汀對小鼠病毒性心肌炎心肌細胞凋亡的影響研究〔J〕.中國循環雜志，2011；26(3)：220-3.

2 高宇囡，楊 茂，陳延軍，等.阿托伐他汀序貫治療對行急診PCI的急性心梗患者心功能的影響〔J〕.哈爾濱醫科大學學報，2012；46(4)：360-3.

3 陳 盼，趙 明，蔣 鵬，等.鹽酸右美托咪定預處理對缺血-再灌注損傷大鼠心肌Bax和Bcl-2表達的影響〔J〕.重慶醫學，2012；41(16)：1604-7.

4 周 煒，陳 玲，周 逸，等.阿托伐他汀下調大鼠心肌梗死后線粒體融合素2表達和細胞凋亡〔J〕.基礎醫學與臨床，2014；34(2)：168-71.

5 史婷婷，白建平，梁月琴，等.芹菜素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響〔J〕.中國藥理學通報，2011；27(5)：666-70.

6 孟 紅，張英杰.阿托伐他汀對大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響〔J〕.中國全科醫學，2009；12(6)：465-8.

7 孫曉靖，陳玉嵐，張向陽，等.普伐他汀與阿托伐他汀對急性損傷大鼠心肌細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響〔J〕.中國全科醫學，2013；16(21)：2470-2.

8 王素云，王海蕓，黃曉燕，等.阿托伐他汀對大鼠缺血心肌TRAIL表達及細胞凋亡的影響〔J〕.溫州醫學院學報，2012；42(4)：317-21.

9 高玉峰，王小杰，閆文翠，等.生黃合劑對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡相關基因Bax，Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2012；18(13)：244-7.

10 高鳳敏，安錦丹，郭繼芳，等.阿托伐他汀預處理對大鼠缺血-再灌注心肌氧自由基和凋亡的影響〔J〕.中國急救醫學，2013；33(5)：465-7.

〔2015-12-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

萬琪琳(1962-)，女，主任醫師，碩士生導師，主要從事冠心病、老年病學研究。

姚新亮(1983-)，男，碩士，主治醫師，主要從事冠心病研究。

R54

A

1005-9202(2016)19-4726-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.024