鹽脅迫下耐鹽苜蓿突變體的紅外光譜分析

楊靜慧，王　敏，李 雕，秦艷筠，張偉玉，楊仁杰

（1.天津農學院 園藝園林學院，天津 300384；2.天津農學院 工程技術學院，天津 300384）

鹽脅迫下耐鹽苜蓿突變體的紅外光譜分析

楊靜慧1，王敏1，李 雕2，秦艷筠1，張偉玉2，楊仁杰2

（1.天津農學院 園藝園林學院，天津 300384；2.天津農學院 工程技術學院，天津 300384）

為了研究青睞耐鹽突變體的耐鹽生理機制，以青睞和青睞耐鹽突變體為試驗材料，采用中紅外光譜技術，結合二階導數圖，對其鹽脅迫條件下官能團的變化進行了比較。結果表明：在鹽脅迫條件下，苜蓿比對照增加了1個吸收峰（1 862 cm-1波數），為酸酐類C=O官能團；耐鹽苜蓿突變體比對照增加了1個吸收峰（1 440 cm-1波數），對應的官能團為C-H，為飽和烴類，包括烷烴、環烷烴、芳香烴類等，減少了1個吸收峰（1 640 cm-1波數），即萘環C=C官能團。在正常生長條件下，耐鹽突變體比普通苜蓿多了2個吸收峰（1 589 cm-1和1 640 cm-1），對應的官能團是胺類、酰胺類N-H和脂肪酸類C=O；少了1個吸收峰（1 608 cm-1），對應的官能團是芳烴類C=C。總之，分析顯示鹽脅迫變化的敏感特征峰普通苜蓿為1 862 cm-1，耐鹽苜蓿突變體為1 440 cm-1，耐鹽突變體的紅外光譜檢測發現了3個大的差異峰。所以，紅外光譜分析技術可以用于突變體鑒定。

苜蓿；突變體；鹽脅迫；紅外光譜

苜蓿被譽為“牧草之王”，也是世界公認的健康食品和中草藥[1]。苜蓿是綠肥,是豆科植物，具有固氮作用，在抗旱、抗風沙、防止水土流失、改良土壤、保護生態環境等方面也起到積極的作用[2]。但是，苜蓿的耐鹽性還有待提高，以用于鹽堿地的改良[3]。近年來，苜蓿的耐鹽育種研究逐漸增加，獲得了大量的突變體[4-5]。如何進行突變體的快速鑒定是育種研究者急于解決的問題。是否能將分析速度快、樣品無損耗、成本低和無污染[6-7]的紅外光譜技術用于苜蓿突變體的篩選和分析突變體變異的主要官能團和成分是本研究的主要目的。

1　材料和方法

1.1材料

苜蓿品種為青睞，青睞植株（CK）和青睞突變體的普通愈傷組織和松散型胚性愈傷組織由天津農學院園林植物實驗室提供。其中青睞突變體是在0.3%EMS（誘變劑）和0.6%NaCl濃度的培養基上通過耐鹽篩選得到耐鹽突變愈傷組織，再經過細胞再生獲得的突變體。普通愈傷組織和松散型胚型愈傷組織的誘導按照劉艷軍[8]和秦艷筠[9]的方法獲得。

1.2方法

1.2.1樣品耐鹽處理和采集

將不同處理的愈傷組織分別稱取0.5 g，放進紗布中，浸入2%鹽水中1 h。對照為清水浸泡。每處理3次重復。再將其放進烘干箱，先在105 ℃條件下烘干30 min，然后于55 ℃下持續烘干900 min，至完全干燥。粉碎，過0.15 mm準篩。各取1.5 mg，KBr 紅外光譜儀—KBr壓片法制樣，測定。每處理設4次重復。

1.2.2樣品測定和數據分析

采用PerkinElmer公司FT-IR Spectrometer Froniter紅外光譜儀對上述樣品壓片通過透射方式進行紅外采集，DTGS檢測器。光譜分辨率4 cm－1，測量范圍4 000～400 cm-1，OPD速度0.2 cm·s-1,增益為1,每個樣品累計掃描16次。掃描時扣除H2O和 CO2的干擾。光譜采集和一維、二維譜分析均采用Pekin Elmer公司的Spectrum v 5.0.1軟件處理獲得;2維平滑點數為11。運用origin7.5軟件進行紅外光譜與二階導數紅外光譜分析。

2　結果與分析

2.1鹽脅迫下普通苜蓿的紅外光譜分析

從圖1中可以看出，對照CK與鹽脅迫處理后的苜蓿愈傷組織（苜蓿鹽脅迫）的紅外光譜圖無明顯差異，有5個波峰，分別是 1 052 cm-1、1 401～1 404 cm-1、1 599～1 608 cm-1、2 933 cm-1、3 348 cm-1，其中在1 052 cm-1波數上的吸收峰是醇類C-O、醚類 C-O-C (脂肪烴)、胺類C-N（烷基碳）伸縮振動吸收。在1 401～1 404 cm-1波數上吸收峰是酸類O-H面內變形振動吸收。在1 599～1 608 cm-1波數上吸收峰是芳烴類C=C苯環骨架振動吸收、胺類N-H變形振動吸收、酰胺類N-H（伯酰胺）變形振動吸收。在2 933 cm-1波數上的吸收峰是酸類O-H（二聚體）伸縮振動吸收。在3 348 cm-1波數上的吸收峰是醇類O-H、胺類N-H、酰胺類N-H伸縮振動吸收。

圖1　苜蓿與鹽脅迫下苜蓿的紅外光譜圖

2.2鹽脅迫下普通苜蓿的二階導數分析

從二階導數圖中可以看出，苜蓿愈傷組織鹽脅迫處理后比對照增加了1個特征峰，波數是1 862 cm-1，對應的官能團為酸酐類C=O，該類物質為酸類，包括無機酸和有機酸。苜蓿突變體鹽脅迫后酸類物質有所增加，這與孫偉澤在NaCl 脅迫對紫花苜蓿七種生理生化指標影響研究一文中提到的植物在鹽脅迫下通過分泌有機酸，阻止鹽分進入體內的內容相符合。進一步推測這種酸類物質可能是茉莉酸類物質（JAS）。

JAS被公認為一類新型植物內源生長物質,這類化合物具有生長物質活性。植物在機械傷害、病蟲害、干旱、鹽脅迫等條件下的抗逆反應都與茉莉酸類物質的作用密切相關。在環境脅迫條件下JAS是驅動植物防御基因表達過程中信號傳遞的必要組成部分。在創傷、水分虧缺和滲透脅迫時，燕麥、大豆、煙草、擬南芥、大麥和玉米等植物中內源 JAS 含量急劇上升[10]。所以，1 862 cm-1吸收峰是苜蓿鹽脅迫反應的特征峰。

2.3鹽脅迫處理下的耐鹽苜蓿突變體的紅外光譜分析

從圖2中可以看出，對照CK的二階導數圖有16個吸收峰，鹽脅迫處理的有17個吸收峰。其中共同峰是在波數696～1 812 cm-1范圍內，696 cm-1波數對應的是酰鹵類C=Cl伸縮振動、芳烴類C-H（單取代）、C-H（間位雙取代）面外變形振動，在767 cm-1波數對應的是芳烴類C-H（間位雙取代）面外變形振動，832～834 cm-1波數對應的是芳烴類C-H（對位雙取代）的面外變形振動吸收，920～922 cm-1波數對應的是酸類O-H的面內變形振動吸收和酸酐類的C-O伸縮振動吸收，996～998 cm-1波數對應的是酸酐類C-O的伸縮振動吸收，1 050 cm-1波數對應的分別是醇類的C-O、醚類的C-O-C（脂肪烴）、酸酐類C-O、胺類的C-N（烷基碳）的伸縮振動吸收，1 150 cm-1波數上對應的分別是醇類的C-O、醚類的C-O-C（脂肪烴）、胺類的C-N（烷基碳）、酮類的C-C的伸縮振動吸收，1 240 cm-1波數對應的分別是醇類C-O、醚類C-O-C（脂肪烴）、酸類C-O-C、酯類C-O-C（乙酸酯）、酮類C-C的伸縮振動吸收，1 329 cm-1波數對應的是胺類C-N(芳基碳)的伸縮振動吸收，波數1 438～1 440 cm-1對應的是酸類O-H面內變形振動吸收，1 500 cm-1波數對應的是胺類N-H變形振動吸收，1 528～1 529 cm-1波數對應的是胺類N-H、酰胺類N-H(仲酰胺)變形振動吸收，1 600 cm-1波數對應的是胺類N-H、酰胺類N-H（伯酰胺）變形振動吸收，酰胺類C=O伸縮振動吸收，1 740 cm-1波數對應的是酸類C=O、酯類C=O、酸酐類C=O伸縮振動吸收，1 812 cm-1波數對應的是酸酐類C=O伸縮振動吸收。

圖2　苜蓿與鹽脅迫下苜蓿的二階導數紅外光譜圖

從圖3中可以看出，鹽脅迫下苜蓿突變體與對照CK的紅外光譜圖大體相似，有6個波峰。分別在1 049～1 052 cm-1、1 403～1 404 cm-1、1 589～1 596 cm-1、1 640～1 665 cm-1、2 926 cm-1、3 348 cm-1。各吸收峰對應的官能團同前2.1。

圖3　鹽脅迫下苜蓿突變體的紅外光譜圖

2.4鹽脅迫下苜蓿突變體的的二階導數分析

從圖4可以看出，鹽脅迫下的苜蓿突變體與對照CK的二階導數圖分別有18、17個吸收峰。各吸收峰對應的官能團同前2.2。在1 401～1 500 cm-1波數區間，鹽脅迫使苜蓿突變體比對照CK增加了1個特征峰，波數是1 440 cm-1，對應的官能團為C-H，為飽和烴類，對應的物質為烷烴、環烷烴、芳香烴類等。但是，在1 500~1 680 cm-1波數范圍內，鹽脅迫使苜蓿突變體比對照CK減少了1個特征峰，該峰的波數是1 640 cm-1, 對應的官能團為芳烴類C=C。

圖4　鹽脅迫下苜蓿突變體的的二階導數紅外光譜圖

2.5普通苜蓿與苜蓿突變體的紅外光譜分析

從圖5中可以看出，普通苜蓿CK與苜蓿突變體在正常生長條件下的紅外光譜圖有明顯差異，普通苜蓿有5個波峰，苜蓿耐鹽突變體有6個波峰。其中二者共同的吸收峰的波數分別是1 052 cm-1、1 404 cm-1、3 348 cm-1。

在1 404~2 933 cm-1波數范圍內，苜蓿耐鹽突變體增加了2個特征峰，波數分別是1 589 cm-1和1 640 cm-1，減少了1個特征峰，波數是1 608 cm-1，三處波峰對應的官能團相同，但可以從出現特征峰的位置進行區分。

圖5　普通苜蓿與苜蓿耐鹽突變體的紅外光譜圖

2.6普通苜蓿與苜蓿突變體的二階導數分析

從圖6可以看出，普通苜蓿與苜蓿突變體的二階導數圖分別有16和17個吸收峰。在波數696～1 330 cm-1范圍內，共有的峰是696 cm-1、767～768 cm-1、832～836 cm-1、922～924 cm-1、996～998 cm-1、1 050 cm-1、1 150 cm-1、1 240 cm-1、1 329～1 330cm-1波數。

圖6　普通苜蓿、苜蓿耐鹽突變體的二階導數紅外光譜圖

3　結　論

與普通苜蓿相比，耐鹽突變體在1 329～1 500 cm-1范圍內增加的特征峰的波數是1 410 cm-1，減少的特征峰的波數是1 440 cm-1，它們對應的官能團是酸類O-H。在1 500～1 840 cm-1范圍內，耐鹽突變體比普通苜蓿增加1 640 cm-1、1 790 cm-1、1 840 cm-1處的吸收峰，其中1 640 cm-1處對應的官能團是芳酮C=O。在1 790 cm-1和1 840 cm-1處對應的官能團是環酸酐C=O。耐鹽突變體比普通苜蓿減少的特征峰的波數是1 812 cm-1，對應的官能團是酰鹵類C=O。

總之，在鹽脅迫條件下，鹽使苜蓿增加了1個吸收峰1 862 cm-1，為酸酐類C=O；鹽使耐鹽苜蓿突變體增加了1個1 440 cm-1吸收峰，對應的為飽和烴類C-H，減少了1 640 cm-1吸收峰，即芳烴類萘環C=C。

在正常生長條件下，耐鹽突變體與普通苜蓿的差異是，耐鹽突變體增加了2個特征峰（ 1 589 cm-1和1 640 cm-1），減少了1個特征峰，波數是1 608 cm-1，3處波峰對應的官能團一樣，但可以從出現特征峰的位置進行區分。

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試驗研究

S551+.7

A

1002-0659（2016）05-0001-03

2016-03-28

天津市科技成果轉化及產業化推進計劃項目（14ZXNZNC0040）；天津市農委項目（201502100）

主要作者簡介：楊靜慧（1961-），女，教授，博士,主要從事園藝植物栽培、抗逆生理和分子育種研究工作。E-mail: ajinghuiyang2@aliyun.com