未名玫瑰葡萄秋水仙素誘導與鑒定

閆愛玲， 王慧玲，孫 磊，張國軍，王曉玥，徐海英*

(1.北京市農林科學院林業果樹研究所,北京100093；2.北京市落葉果樹工程技術研究中心，北京 100093；3.農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,北京 100093)

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未名玫瑰葡萄秋水仙素誘導與鑒定

閆愛玲1，2， 王慧玲1，3，孫 磊1，2，張國軍1，王曉玥1，徐海英1*

(1.北京市農林科學院林業果樹研究所,北京100093；2.北京市落葉果樹工程技術研究中心，北京 100093；3.農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,北京 100093)

[目的]研究未名玫瑰葡萄秋水仙素處理的最適濃度和時間，及適宜的倍性鑒定方法。[方法]以秋水仙素為誘變劑，利用不同濃度的秋水仙素浸泡種子不同時間，對二倍體葡萄未名玫瑰品種進行加倍誘導，并采用流式分析儀對誘變植株的細胞 DNA 含量進行鑒定。[結果]從誘導成活率和四倍體誘變率綜合考慮，誘變四倍體未名玫瑰種子的適宜條件：當種子胚根長1.0 cm時，用0.5%秋水仙素處理96 h，其成活率和四倍體率分別為11.33%和5.12%。[結論]用倍性分析儀測定細胞倍性是一條簡便快捷的鑒定方法。處理時間是影響成活率、四倍體率和變異率的主要因素。

葡萄；秋水仙素；四倍體；倍性分析

多倍體植物具有生物產量高、器官巨大性、抗病抗逆能力強等特性。多倍體葡萄的葉片、果粒性等比二倍體葡萄更大，抗逆能力更強，在生產上得到大面積的推廣(如巨峰葡萄)。但四倍體葡萄品種單一(主要為巨峰系及后代等歐美品種[1-2])，無法滿足市場需求。因此,對二倍體鮮食葡萄品種或育種親本進行染色體加倍，經篩選獲得四倍體品種，可獲得直接用于生產的四倍體品種，另一方面能獲得四倍體新種質，為進一步育種奠定基礎。

Dermen[3]在夏葡萄(Vitisaestivalis)、歐洲葡萄(V.vinifera)和圓葉葡萄(V.rotundifolia)上獲得了四倍體或嵌合體。我國許多育種工作者均采用秋水仙素處理二倍體葡萄品種的生長點等獲得四倍體葡萄[4]。馬愛紅等[2]、張淑愛等[5]和盧炳芝等[6]利用組織培養的方法，用秋水仙素處理葡萄試管苗莖段和胚狀體，也獲得四倍體。但該方法獲得四倍體品種還需要經過組培苗的培養、移栽、煉苗等過程，較麻煩。在有足夠種子的條件下，陳俊等[7]通過誘導葡萄種子，獲得的四倍體直接從種子發芽生長成苗。筆者以秋水仙素為誘變劑，利用不同濃度的秋水仙素浸泡種子不同時間，對二倍體葡萄未名玫瑰品種進行加倍誘導，并采用流式分析儀對誘變植株的細胞DNA含量進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 取二倍體葡萄品種未名玫瑰的種子，先將種子進行催芽，待胚根長0.5～1.0 cm時進行處理。

1.2 方法

1.2.1 種子浸泡法。將胚根長0.5～1.0 cm的種子浸泡在不同濃度秋水仙素培養皿中，上面蓋一薄層脫脂棉，蓋上培養皿，放置于室溫(25±2)℃的培養間內培養48～96 h。處理后統計各處理成活種子數；播種至營養缽內，溫室發芽成苗。將成活的幼苗移入大田，待長出幾片新葉后，將植株的幼嫩葉片取回，進行DNA檢測。秋水仙素濃度分別為0.4%、0.5%、0.6%，處理時間分別為48、72、96 h，共9個處理。

1.2.2 植株倍性鑒定。采用倍性分析儀進行細胞倍性鑒定。將10 mg新生幼嫩葉片在0.5 mL Pratec HR-A溶液中研磨。將樣品通過30 μmol Pratec Celltrics微孔膜過濾到測試管中，加入0.5 mL Pratec HR-B溶液于樣品中，將樣品上樣于德國Pratec公司生產的倍性分析儀，用流式細胞計數法測定葡萄葉片單個細胞核的DNA含量。測定結果由儀器直接繪制出DNA曲線圖。根據測定結果，確定處理植株的倍性。

2 結果與分析

2.1 胚根和植株的形態變化 從圖1可以看出，與對照相比，秋水仙素處理后胚根明顯粗壯，根尖處由于受秋水仙素毒害而變褐；處理時長勢較弱的種子根部甚至整個種子死亡。

由圖2可看出，秋水仙素加倍后，植株在形態上發生了變化。正常二倍體植株的葉片顏色淺,葉緣鋸齒較圓(圖2a)；而秋水仙素加倍后的植株，葉片顏色為深綠色，葉緣鋸齒尖，葉片裂刻加深，表面光滑而有光澤(圖2b)。

2.2 葡萄植株的倍性鑒定 采用倍性分析儀對未經處理的未名玫瑰二倍體對照植株及采用秋水仙素處理的植株進行倍性分析，典型的二倍體、四倍體及二倍四倍嵌合體的DNA含量分布見圖3。從圖3可以看出，二倍體對照植株僅在峰值 50 的位置出現1 個單峰，四倍體植株在峰值100的位置出現 1 個單峰，而部分植株具有 2 個峰，除峰值50附近有 1 個峰外，在峰值100附近還有 1 個峰，如加倍成嵌合體植株的第 1 個峰值為 49.04，第 2 個峰值為 98.53，兩者比值約為2，即為二倍體和四倍體的嵌合體，還有些植株在峰值約25處出現1個峰，此植株為單倍體植株。

圖1 0.4%秋水仙素處理96 h(a)和清水處理(b)Fig.1 Treatment of 0.4% colchicine for 96 h (a) and clean water control (b)

2.3 不同濃度秋水仙素和不同處理時間對誘變效果的影響 從表1可以看出，隨著處理濃度的增加和處理時間的延長，植株成活率逐漸降低。其中，在秋水仙素濃度為0.4%時，48 h成活率最高，72和96 h成活率差異不顯著；但變異率和四倍體率較低。不同濃度秋水仙素處理成活率由高到低依次為①、④、⑦，其中，處理⑦、②和③差異不顯著，處理⑤和⑧差異不顯著。極差分析表明，處理時間的貢獻率大于處理濃度，即處理時間對成活率的影響大于處理濃度對成活率的影響。變異率和四倍體率則隨著處理時間的延長和處理濃度的增加而增加，變異率最高的是處理⑨，即濃度0.6%的秋水仙素處理96 h變異率最高(為7.63%)，其次是0.5%的秋水仙素處理96 h(變異率為6.37%)，變異率第3的是0.6%的秋水仙素處理72 h(變異率為5.76%)。極差分析表明，處理時間是影響變異率的主要因素。四倍體率最高的也是處理⑨，四倍體率從高到低依次為⑨、⑥、⑧、⑤，這與變異率不同；其中，處理⑨與⑥差異不顯著。極差分析表明，處理時間是影響四倍體率的主要因素。綜上所述，0.6%的秋水仙素處理96 h和0.5%的秋水仙素處理96 h未名玫瑰的發芽種子得到的四倍體后代最多，從成活率和四倍體率綜合考慮，選取0.5%的秋水仙素處理96 h為未名玫瑰種子的最佳處理時間和處理濃度。

圖2 對照二倍體未名玫瑰(a)和秋水仙素加倍后四倍體未名玫瑰(b)Fig.2 The control of diploid Weiming Meigui grape (a) and the tetraploid Weiming Meigui grape after processed by colchicine (b)

注：a.對照二倍體未名玫瑰，b.加倍為四倍體的植株，c.二倍體四倍體嵌合體，d.單倍體植株。Note:a.Diploid; b.Tetraploid; c.The chimera of diploid and tetraploid; d.Haploid.圖3 DNA含量分布Fig.3 Distribution of DNA content

表1 不同濃度秋水仙素和不同處理時間對未名玫瑰誘變效果的影響

注：同列不同小寫字母表示處理間在0.05水平上差異顯著。

Note:Different lowercases in the same column indicated significant difference at 0.05 level.

3 結論與討論

陳俊等[7]用0.6 %的秋水仙素溶液在種子胚根長0.5、1.0、1.3 cm 時進行處理，結果發現，種子萌發后胚根長為1.0 cm 時誘導效果較好。該研究發現，當胚根長小于0.5 cm時耐藥性較弱，種子根部褐化死亡；當胚根長1.0 cm時，其耐藥性大大增強，根部褐化死亡的數量較少。這與陳俊等[7]的研究結果一致。因此，在選材時盡量用胚根長約1.0 cm進行處理。

常金華等[8]、楊曉明等[9]對染色體數目、氣孔特征和花粉粒特性等與倍性有關的性狀進行了鑒定，結果表明，這些方法操作復雜，且難度較大。倍性分析儀為植物染色體倍性的研究提供了一條便捷的途徑，鑒定快速方便，且準確性較高[10]。筆者采用倍性分析儀分析細胞倍性，這與馬愛紅等[2]采用的方法相同，通過對誘變植株 DNA 含量變化進行鑒定，在短時間內可檢測成千上萬個細胞，除檢測速度快外，還可檢測生長點和葉片等非生長點部位，結果可靠全面，并具有一定的代表性。對于未名玫瑰種子,0.5%的秋水仙素處理96 h為最佳處理時間和處理濃度。

[1] 賀普超.葡萄學[M]. 北京:中國農業出版社，1999.

[2] 馬愛紅，范培格，孫建設，等.四倍體葡萄誘導技術的研究[J].中國農業科學，2005,38(8):1645-1651.

[3] DERMEN H. Colchiploidy in grapes[J]. The journal of heredity， 1954，45(4):159-172.

[4] 羅耀武，喬子靖，朱子英,等.人工誘變獲得四倍體玫瑰香葡萄的研究[J].園藝學報，1997，24(2):125-128.

[5] 張淑愛，齊與樞， 魏寶發， 等. 用秋水仙素誘導葡萄試管苗獲得多倍體[J].中國果樹，1989(3):28-30，45.

[6] 盧炳芝，李佩芬，于向榮， 等.誘變葡萄體細胞胚獲得同質四倍體植株的研究[J]. 果樹科學，1997，14(3):145-148.

[7] 陳俊， 李登科， 李太寶， 等. 誘導葡萄多倍體研究[J].果樹科學，1995，12 (3):151-155.

[8] 常金華,任清,羅耀武.人工誘變四倍體玫瑰香葡萄的倍性鑒定[J].核農學報,2003,17(3):221-224.

[9] 楊曉明`,王翠玲.葡萄多倍體誘導及其特征特性研究[J].甘肅農業大學學報，2005,12(6):741-474.

[10] 張俊娥，劉繼紅，鄧秀新. 采用倍性分析儀鑒定柑橘愈傷組織的遺傳變異[J].遺傳學報，2003，30(2):169-174.

Identification and Induction of Weiming Meigui Grape with Colchicine

YAN Ai-ling1，2，WANG Hui-ling1，3，SUN Lei1，2，XU Hai-ying1*et al

(1.Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100093; 2.Beijing Deciduous Fruit Tree Engineering Research Center，Beijing 100093; 3.Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China)，Ministry of Agriculture，Beijing 100093)

[Objective] To research the optimal concentration and time of colchicine treatment for Weiming Meigui Grape，and the optimal ploidy identification method.[Method] With colchicine as the mutagenic agent，seeds were soaked in different concentrations of colchicine for different time，so as to induce theVitisvinifera.Cell DNA of the induced plants were identified by flow cytometry.[Result] Considering the induction survival rate and tetraploid mutation rate，the optimal condition for tetraploid induction (Weiming Meigui seeds) was when seed radical was 1 cm in length，it was treated by 0.5% colchicine for 96 h,the rate of tetraploid was 5.12% and the survival rate was 11.33%.[Conclusion]The ploidy analyzer is a simple,rapid method for determining cell ploidy.Treatment time is the main factor affecting the survival rate，tetraploid rate and mutation rate.

Grape (Vitisvinifera); Colchicines; Tetraploid; Analysis of ploidy

國家葡萄產業技術體系(CARS-30-YZ-3)。

閆愛玲(1972- )，女，新疆阿克蘇人，副研究員，碩士，從事葡萄資源與育種研究。*通訊作者，研究員，碩士，從事葡萄育種研究。

2016-08-19

S 663.1

A

0517-6611(2016)28-0106-03