蛇龍珠等釀酒葡萄品種羧酸酯酶基因片段的SNP分析

陳小宇， 劉林德*， 葛宜和， 張 莉，李記明， 姜文廣， 裴廣仁

(1.魯東大學生命科學學院，山東煙臺 264025;2.煙臺張裕集團有限公司，山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東煙臺 264001)

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蛇龍珠等釀酒葡萄品種羧酸酯酶基因片段的SNP分析

陳小宇1， 劉林德1*， 葛宜和1， 張 莉1，李記明2*， 姜文廣2， 裴廣仁2

(1.魯東大學生命科學學院，山東煙臺 264025;2.煙臺張裕集團有限公司，山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東煙臺 264001)

[目的]利用單核苷酸多態笥(SNP)分析蛇龍珠等釀酒葡萄的單核苷酸多態性及遺傳親緣關系，為今后研究釀酒葡萄的抗性機制以及培育抗病性葡萄提供參考。[方法]以釀酒葡蛇龍珠8個新株系(E01～E08)、品麗珠、 赤霞珠為材料，以歐亞種黑比諾為對照，對羧酸酯酶基因(CXEs)片段進行克隆和序列分析，研究蛇龍珠等釀酒葡萄之間的遺傳差異。[結果]序列對比顯示，該基因片段在編碼區和非編碼區均存在不同程度的堿基替換。11份葡萄材料的基因片段共發現87個多態性位點，平均74 bp左右的序列長度上能夠檢測到一個SNP位點，核苷酸多樣度(Pi)0.050 76±0.011 49，單倍型多樣度(Hd)1.000±0.039，表現出豐富的遺傳多樣性。3種中性檢驗方法比較序列變異模式，結果符合中性生化模型。通過聚類分析可將蛇龍珠E02、E03聚為一類，E07、E08聚為一類，其遺傳距離和地理距離一致。該序列片段存在一些突變，這些突變能將蛇龍珠8個新株系與其他釀酒葡萄品種明顯區分。[結論]CXEs基因片段的突變位點可作為遺傳標記，利用SNP方法可分析葡萄的遺傳多樣性和親緣關系。

蛇龍珠；羧酸酯酶；基因克隆；序列分析

羧酸酯酶(Carboxylesterases，CXEs)是一種多功能酶，廣泛存在于生物界中，能夠催化各種水解反應[1]。羧酸酯酶的功能較多，在哺乳動物和昆蟲體內分別參與藥物的代謝和殺蟲劑的代謝，在微生物中參與降解作用[2-3]。目前關于植物羧酸酯酶的研究較少。植物中的羧酸酯酶在代謝殺蟲劑[4]和病原菌的致病過程中[5]起重要作用。單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)作為第三代分子標記[6]，在遺傳多樣性分析[7]、遺傳連鎖圖譜構建[8]、品種鑒定[9]以及性狀的基因定位[10]等研究中應用廣泛。近年來，歐洲釀酒葡萄的基因組框架圖和全基因組測序的完成[11-12]，以及大量EST序列和cDNA序列的公布[13]，為從分子水平研究葡萄的遺傳多樣性提供了大量信息，同時也為葡萄CXEs基因的深入研究提供了條件。

葡萄是我國重要的栽培產物之一，葡萄病害嚴重影響葡萄的產量和品質[14]，培育抗病葡萄品種是葡萄育種的重要工作，羧酸酯酶在病原菌的致病過程中起重要作用。筆者通過對釀酒葡萄羧酸酯酶基因片段進行克隆和測序，利用SNP分析蛇龍珠等釀酒葡萄的單核苷酸多態性及遺傳親緣關系，為今后研究釀酒葡萄的抗性機制以及培育抗病性葡萄提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 釀酒葡萄8個蛇龍珠新株系(E01：蓬萊，E02：棲霞北，E03：棲霞南，E04：煙臺市幸福街道；E05：萊山；E06：龍口；E07、E08：煙臺開發區)，品麗珠、赤霞珠、黑比諾材料，由煙臺張裕葡萄種質園提供。

1.2 葡萄總DNA的提取 采用Ezup Column Plant Genomic DNA Purification Kit提取基因組總DNA(Sangon,Biotech.Shanghai.Cat.:SK8262)，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，超微量分光光度計(P 300)檢測DNA純度和濃度。

1.3CXEs基因片段的克隆 擴增引物C4來自文獻[15]，PCR 反應體系50 μL：10×Buffer 5 μL，Mg2+4 μL(25 mmol/L)，dNTPs 4 μL (2.5 mmol/L)，引物1.25 μL(10 μmol/L)，1 UTaq聚合酶，50 ng模板DNA。PCR反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳分離，凝膠成像系統下觀察。PCR產物純化回收后送至上海生工生物工程有限公司進行單向測序。

1.4CXEs基因片段的序列分析 將測序結果在NCBI上的BLAST程序與己登錄的葡萄屬植物進行同源性比對。利用BioEdit version 7.0.5軟件進行人工調整，利用軟件ClustalX 2.0將測序的11個樣品進行序列比對，MEGA 5.0進行系統發育分析，采用鄰接法(Neighbour Joining，NJ)構建系統發育樹，以Bootstrap進行1 000次可信度分析。利用SNiPlay在線工具(http://sniplay.cirad.fr)對序列SNP出現的頻率、突變位點以及多態性[16]進行分析，核苷酸多樣度(Pi)、單倍型多樣度(Hd)、中性檢測運用DnaSP 5.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果 利用引物對11份葡萄材料的基因組總DNA進行PCR擴增，在600 bp附近得到1條明亮清晰的條帶(圖1)，測序后得到葡萄的CXEs基因序列。

2.2CXEs基因片段的序列比對及氨基酸序列比對 陽性克隆測序成功后，利用NCBI上的BLAST對目的片段進行同源性比對，結果顯示其與已登錄的葡萄屬CXEs基因序列(基因登錄號：XM_0106626666.1)的同源性高達99%，將目的片段產物的氨基酸序列進行同源性比對，結果顯示其與已登錄的葡萄屬CXEs氨基酸序列(基因登錄號：XP_010660968.1)的同源率高達94%，因此確定該段序列為CXEs基因中一段序列。

注：M.DL 10000 DNA marker；1～8.蛇龍珠E01～E08；9.品麗珠；10.赤霞珠；11.黑比諾。Note：M.DL 10000 DNA marker; 1-8.Cabernet Gernischt E01-E08;9.Cabernet Franc;10.Cabernet Sauvignon;11.Pinot Noir.圖1 PCR純化產物凝膠檢測圖譜 Fig 1 Gel electrophoresis of PCR purification products

注： *表示相似性100%。Note:*：100% identity on sequence.圖2 CXEs基因片段序列比對Fig.2 The sequences alignment of CXEs gene segments

注：*表示該列殘基完全一致，：表示該列僅包含非常保守的殘基替換，.表示該列含有比較保守的殘基替換。Note：* indicates exactly the column residues ,: indicates that the column contains very conservative residues，.indicates that the column contains relatively conservative residues.圖3 CXEs基因片段氨基酸序列比對Fig.3 The amino acid sequence alignment of CXEs gene segments

CXEs基因片段的序列比對結果見圖2，核苷酸序列有差異，將供試材料與NCBI上黑比諾的CXEs基因進行序列比對，在編碼區和非編碼區均存在不同程度的堿基突變。編碼區在51～319 bp位置，非編碼區的單核苷酸多態性位點明顯多于編碼區，包括堿基的顛換和轉換，說明該區域的遺傳多樣性較豐富。

表1 CXEs基因序列的SNP特征

利用MEGA 5.2軟件將測序所得的核苷酸序列轉換成相應的氨基酸序列(圖3)，經BioEdit version 7.0.5軟件分析發現該基因片段起始密碼子是ATG，位于51～53位核苷酸，終止密碼子是TGA，位于317～319位核苷酸，開放讀碼框267 bp，編碼89個氨基酸。蛇龍珠CXEs基因片段的非編碼區氨基酸序列表現出較高的多態性。

2.3CXEs基因片段的SNP特征分析 11個樣品的克隆片段大小在608～615 bp，其中，A含量在25.0%～26.6%，C含量在22.1%～23.3%，G含量在18.2%～19.2%，T含量在31.9%～33.9%。該基因片段共檢測出11個二等位SNPs(表1)。基因突變類型包括基因顛換和基因轉換，突變位點的等位基因大部分為純合子。在這些二等位SNPs中，內含子區域7個，外顯子區域4個，在外顯子中有1處堿基突變使編碼的氨基酸單核苷酸發生改變(Q/K)。

2.4CXEs基因片段的遺傳多樣性分析和中性檢驗 利用DnaSP 5.0軟件將測序得到的核苷酸序列進行遺傳多樣性分析，結果表明，其多態性位點數87，突變位點數87，單倍型數量11，單倍型多樣度(Hd)為1.000±0.039，核苷酸多樣度(Pi)為0.050 76±0.011 49， Tajima′s D、Fu and Li′s D和Fu and Li′s F 3種中性檢驗均為正值(0.006 79、0.388 96、0.330 08)，且不顯著，符合中性進化模型，說明這些葡萄樣品未發生種群擴張。

2.5 進化樹分析 采用MEGA 5.0軟件中的NJ方法構建系統進化樹(圖4)，11個樣品被分成2個分支，4個亞組。第一個分支包括黑比諾和赤霞珠。第二個分支包括2個亞組，品麗珠為第一亞組，來自不同地區的8個蛇龍珠聚為第二亞組。蛇龍珠與品麗珠關系較近，來自棲霞北的E02和來自棲霞南的E03聚為第一小分支，來自煙臺開發區的E07和E08聚為第二小分支，來自龍口的E06、來自蓬萊的E01、來自煙臺市幸福街道的E04、來自萊山的E05各為一小分支。來自相同地區的蛇龍珠E03和E02，蛇龍珠E07和E08各聚為一類，說明供試材料蛇龍珠8個新株系存在遺傳變異和地理分化，遺傳距離與地理距離一致。

圖4 不同材料CXEs基因片段的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of CXEs gene from different samples

3 結論與討論

基因序列數據庫的獲得促進除農作物SNP標記模型外其他植物的發展[17]。大量植物抗病基因已經被確定，其中大部分已經標記了SNP位點[18]。該研究中，該基因片段共發現87個突變位點，平均74 bp左右有1個SNP位點，SNP頻率1.70%～29.00%，Velasco等[12]研究葡萄品種雜合子基因組的高質量共識序列，結果表明，在葡萄遺傳連鎖圖譜中SNP頻率為4.0%，黑比諾每100 bp有1個SNP位點。這可能是由于蛇龍珠經過長期的人工培育和自然選擇，其基因組產生更多的SNP位點[19]。這些SNP位點對于遺傳鑒定、遺傳多樣性分析和親本鑒定具有重要作用。

該試驗測序得到的CXEs基因片段的核苷酸序列有較大差異，共有11個二等位SNP位點，其中，非編碼區有7個SNP位點，編碼區有4個SNP位點，非編碼區的單核苷酸多態性位點多于編碼區，而在自花授粉的玉米和棉花的單核苷酸多態性研究中也得出了“非編碼區的單核苷酸多態性位點多于編碼區”的結論[20-21]。Dong等[17]研究11個歐亞種和5個歐美種的SNP特征,結果表明，基因轉換70%，基因顛換20%。Yang等[22]通過計算機輔助分析表達序列標簽(EST)研究番茄的SNP，結果表明，基因轉換58.1%，基因顛換39.5%。而該試驗得出基因轉換的頻率(71.8%)也高于基因顛換(20.7%)，與前人的研究結果一致。

通過CXEs基因片段序列差異性構建的系統進化樹可以有效地將蛇龍珠8個新株系及品麗珠、赤霞珠和黑比諾進行聚類分析，且聚類分析和地理距離具有相關性；這些葡萄樣品的CXEs基因片段Pi(0.050 76±0.011 49)高于王佳媛等[23]得出的凹葉木蘭Pi(0.017 8)以及Zhu等[24]得出的大豆Pi(0.001 2)，Pi和Hd的數值越大，其多樣性程度越高，遺傳多樣性越豐富，說明該基因片段具有較高的遺傳多樣性。綜上所述，該基因片段可作為一種遺傳標記用于鑒別葡萄的親緣關系。植物在進化過程和多年栽培過程中發生變異引起個體之間的差異，這些差異決定植物的品種、特性等[25]。酯酶基因擴增及突變是酯酶參與抗性的主要方式[26]，今后可對抗性基因的單核苷酸進行關聯研究，為分子標記輔助育種開發可利用的單核苷酸標記提供理論依據。

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The SNP Analysis of Carboxylesterases in Cabernet Gernischt (Vitis vinifera L.)and Other Wine Grape Cultivars

CHEN Xiao-yu1，LIU Lin-de1*，GE Yi-he,LI Ji-ming2*et al

(1.School of Life Science，Ludong University，Yantai，Shandong 264025;2.Shandong key Laboratory of Microbial Fermentation Technology of wine,Yantai Zhangyu Group Co. Ltd.,Yantai Shandong 264001)

[Objective] The aim was to analyze mononucleotide polymorphism and genetic relationships of Cabernet Gernischt (VitisviniferaL.)and other wine grape cultivars，provide reference for study on resistance mechanism of wine grape and cultivation of disease resistant grape.[Method] The difference among Carboxylesterase gene fragments was analyzed to investigate the genetic diversity of Cabernet Gernischt and other wine grape cultivars.Eight new strains of Cabernet Gernischt (E01-E08)，Cabernet Sauvignon，Cabernet Franc were used as experimental materials and Pinot Noir (V.vinifera) were taken as control materials，Carboxylesterase gene fragments were cloned and analyzed.[Result] The analysis of Carboxylesterase gene fragments sequence alignment showed that there were different degrees of base substitutions between the samples in the coding and non-coding regions.A total of 87 SNPs were detected in the sequenced fragments，a SNP locus was found on every 4 bp sequence on average.Nucleotide diversity (Pi) =0.050 76 (±0.011 49)，Haplotype diversity (Hd)=1.000 (±0.039) which give a high leve1 of polymorphism.Three neutrality tests were used to compare the patterns of sequence variations，the result indicates conform to neutral mutation.The clustering dendrogram was constructed by Neighbour Joining (NJ)，Cabernet Gernischt E02 (north of qixia) and E03 (south of qixia) classified into one group，E07(development zone) and E08 (development zone) classified into one group，genetic distance in accord with geographic distance.The results of the experiment showed that there were several mutations in the Carboxylesterase gene fragments might be selected to be the molecular marker to distinguish Cabernet Gernischt eight new strains and other wine grape varieties.[Conclusion]The mutation site of CXEs gene fragment can be used as a kind of genetic marker,SNP method can identify genetic relationships of grape.

Cabernet Gernischt; Carboxylesterase; Gene cloning; Sequence analysis

煙臺市科技發展計劃項目(2012JH204)；泰山產業領軍人才工程專項；國家高技術研究發展計劃項目(2013AA102108)。

陳小宇(1991- )，女，山東德州人，碩士研究生，研究方向:種群群落生態學。*通訊作者，劉林德，教授，博士，碩士生導師，從事種群生態學和遺傳學研究；*通訊作者，李記明，研究員，博士，博士生導師，從事葡萄和葡萄酒方面的研究。

2016-08-11

S 188

A

0517-6611(2016)28-0109-05