輪蟲在環境工程微生物學實驗教學中的應用

楊曉凡，徐曉平

(1.安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖 241000；2.安徽工程大學建筑工程學院，安徽蕪湖 241000)

?

輪蟲在環境工程微生物學實驗教學中的應用

楊曉凡1，徐曉平2

(1.安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖 241000；2.安徽工程大學建筑工程學院，安徽蕪湖 241000)

環境微生物學是高等學校環境工程的專業基礎課，該課程實驗教學中包括大量原核微生物，實驗難度較大。為了克服上述問題，結合教師科學研究項目，選擇培養簡單、繁殖迅速的微型后生動物輪蟲作為測試對象，新開了6個實驗項目。結果表明，輪蟲在實驗教學中的應用突出了環境專業的特點，提高了學生的學習興趣，取得顯著的教學成效。

輪蟲；環境微生物學；實驗教學

環境工程微生物學實驗作為培養環境工程類工科人才的實踐性教學環節，對培養學生運用微生物知識解決實際環境問題的能力和開發學生的創造力至關重要。安徽工程大學于2004年開辦了環境工程專業，在數十年的教學實踐中不斷發現問題并進行創新和嘗試，在環境工程微生物實驗教學上積累了豐富的經驗。筆者結合環境學科教師科研方向，選擇微型后生動物輪蟲作為測試生物，依托環境學科的師資力量開展了新的實驗內容，融合了環境學科教學與科研資源，強化了基礎實驗的學科特性，收到了較好的成效。

1 實驗教學面臨的問題與發展困境

以往的環境工程微生物學實驗教學存在很多問題：實驗生物以單一的原核微生物為主；教學體系上簡單地延續了生物技術或生物工程類等生物專業實驗；實驗難度較大，各項實驗之間連續性和遞進性不強；內容與工程實踐應用脫節，常用的環境微生物很少被提及，難以激發學生學習和探索的興趣。另一方面，環境工程專業涉及化學、水力學、測量學、微生物學、電工學等諸多基礎學科，由于師資條件的限制，教學任務不可能在1個專業甚至1個學院完成，跨專業和學科師資共享是常態，從而給實驗教學的專業性和實踐特性的提升帶來困難。目前，很多學校環境工程微生物學實驗依托生物專業或基礎教學部門開設，實驗內容強調微生物學共性，很難體現環境微生物學的專業特性，在一定程度上影響教學質量的提高。

2 輪蟲在生態環境中的地位和應用

2.1 輪蟲的生物學特征 輪蟲是袋形動物門輪蟲綱近2 000種微小無脊椎動物的統稱，廣泛分布于湖泊、池塘、江河、近海等各類淡、咸水水體中。常見的有旋輪屬(Philodina)、豬吻輪屬(Dicraniphorus)、腔輪屬(Lecane)和水輪屬(Epiphanes)等。輪蟲形體微小，一般長40～200 μm,身體為長形，分頭、軀干和足，頭部有纖毛組成的能轉動的輪盤，形如車輪，故稱為輪蟲。輪蟲雌雄異體，卵生，多為孤雌生殖(圖1)[1]。

圖1 輪蟲雌體形態結構模擬Fig.1 Simulation of female morphology and structure

2.2 水生態鏈中的關鍵生物 在水生環境中，輪蟲是后生動物中擁有最高繁殖速率的一個類群，在各類淡水水體中，其密度通常在 1 000 個/L以上[2-3]，在食物充足的條件下更高[4-6]。輪蟲能夠極其迅速地搶占生態系統中空生態位，將初級生產量(藻類和細菌等)轉化成次級消費者(昆蟲、甲殼動物和魚類的幼體等)可利用的形式，轉換效率高，繁殖快，總浮游生物現存量的30%由其產生。因此，輪蟲在生態系統結構功能、能量傳遞及物質轉換上發揮重要作用[7]。在水產養殖中，輪蟲是蝦、蟹及魚類等水產幼苗的優質食物[8]。

2.3 凈化水質 輪蟲的輪形器官造成水的旋動，使水流向其頭部前端，以便于捕食水流卷來的細菌、霉菌、藻類、原生動物以及有機微顆粒，阻止水體因過多有機物停滯而造成水質污染。輪蟲的廢棄產物會結合成黏性團塊，能吸附其他有機物的顆粒，增強水體的深沉性能，從而凈化水質。針對輪蟲的這一作用，可將輪蟲運用于水污染綜合治理實踐中[9]。

2.4 指示生物 輪蟲是污水處理廠出水達標的指示生物。輪蟲在活性污泥廢水處理系統正常運行，且有機物含量較低以及出水水質良好時才會出現，故輪蟲的存在說明污水處理效果較好。但是豬吻輪蟲是生化池運行失調的指示生物，因污泥齡較長，負荷較低，污泥因缺乏營養而老化解絮，豬吻輪蟲可因污泥碎屑增多而大量繁殖，這是污泥老化解絮標志[10]。富營養化嚴重影響輪蟲的種群結構和數量[11-12]，因此輪蟲也是水體富營養化的指示生物。輪蟲對被測試化學物質敏感[13-15]，是有毒物質環境毒理測試理想的指示生物。20世紀90年代初，美國材料與實驗協會(ASTM)開始以輪蟲作為測試生物制定了水質急性毒性測試標準[16]。

2.5 抑制生物膜的老化 根據生物膜的生長過程，生物膜經過潛伏期、增長期和穩定期之后，必將進入老化脫落期，影響生物膜的活性和污水處理效果。輪蟲可作為生物膜法應用的理想微型動物，可以延長生物膜上食物鏈的長度，增強對低營養級生物的捕食強度，達到去除過量生物膜的目的。在生物膜處理中，輪蟲的參與可以有效控制細菌的數量和增強生物膜活性[9]。

輪蟲在生態環境及水生物處理工程中應用廣泛，是真核生物域微型后生動物的典型代表，因此，輪蟲知識是環境專業學生應該掌握的基礎知識。目前，輪蟲是環境生態學中的一個研究熱點，將其引入實驗教學，能夠促進教學和科研的融通，并且輪蟲培養方便，增殖迅速，具有生物實驗材料的通性。因此，輪蟲的引入有利于化解環境微生物學的實驗窘境，增強教學的專業相關性，激發學生的學習興趣。

3 輪蟲在實驗中的應用方法

輪蟲作為實驗生物材料，實驗周期可控，操作簡單。其在環境工程微生物實驗中的運用除了顯微鏡的使用和微生物的形態觀察、液體培養基的配制與滅菌、微生物的計數和測量等常規微生物專項實驗，還涉及輪蟲的急性毒性、藻類生長抑制、水體富營養化評價與治理等實踐性實驗。現將主要的實驗應用和方法總結如下。

3.1 輪蟲的采集與培養 實驗材料包括旋輪蟲或萼花臂尾輪蟲，采自校園池塘水，喂食斜生柵藻。斜生柵藻由中國科學院武漢水生生物研究所提供。HB-4培養液[17]培養斜生柵藻，輪蟲培養液采用EPA配方[18]。輪蟲和斜生柵藻置于光照培養箱中培養，溫度(20±1) ℃，光照與黑暗比為16 h∶8 h。輪蟲培養液7 d更換2次，保持投藻密度為2.0×106～3.0×106cells/mL。斜生柵藻培養液需要人工配制后溫熱滅菌，因此可以讓學生掌握液體培養基的配制方法，理解濕熱滅菌的過程和原理。在培養過程中，輪蟲可就地取材，突出環境微生物學的實踐特性。

3.2 顯微鏡的使用和微生物的觀察 實驗目的是讓學生熟練掌握顯微鏡的操作方法，并觀察不同種屬輪蟲以及斜生柵藻等微生物的個體形態，學會繪制生物圖。吸取1滴實驗室培養的高密度旋輪蟲、萼花臂尾輪蟲培養液，輕輕滴在載玻片上，不蓋蓋玻片。破壞液滴的凝聚狀態下，直接在顯微鏡下觀察液膜里的輪蟲運動和形態。如有必要，可以采用甲醛固定。以同樣的方法觀察活性污泥中的豬吻輪蟲以及其他原生動物。

3.3 微生物的計數 在實驗過程中，指導學生利用血球計數板對斜生柵藻的濃縮液進行稀釋并計數，計算一定體積輪蟲培養液的斜生柵藻的濃縮液投放量，配制不同濃度的藻培養液。在實驗過程中，可先指導學生對不同密度的輪蟲水樣進行計數，由簡入繁，實驗材料從真核生物藻跨越到后生動物輪蟲，豐富了實驗內容。

3.4 水生生物毒性測定 輪蟲生態毒理學研究常用的實驗指標主要集中在死亡率、行為學、繁殖和種群動態、生化指標等方面。實驗中以Cr6+為例，研究重金屬對輪蟲的急性毒性效應。設置不同的Cr6+暴露濃度，分別盛入5 mL的小燒杯，每個小燒杯放入10個輪蟲，重復3次，設無菌水空白對照，分別于24和48 h觀察輪蟲的存活量，以濃度的常用對數為橫坐標，死亡率的概率單位為縱坐標，通過回歸方程求得24和48 h的半致死濃度。微藻也是敏感的指示生物，可采用投喂輪蟲的斜生柵藻作為生物材料，開展環境污染物對指數生長期斜生柵藻的抑制實驗，96 h后應用血球計數板或浮游植物計數框在顯微鏡下直接計數，觀察污染物暴露濃度對藻的生長量的影響，計算半數效應濃度(EC50)。

3.5 水體富營養化的評價 AGP實驗是研究水體富營養化問題的一個重要手段。在飼養輪蟲過程中，以投喂輪蟲的斜生柵藻為測試生物開展了藻類的潛在生產力實驗。將培養液用濾膜(1.2 μm)或高壓滅菌器(121 ℃，15 min)除去固體懸浮物(SS)和雜菌。取500 mL置于L型培養管(1 000 mL)，接入斜生柵藻，將培養管放入往復振蕩搖床上，在20 ℃、光照為4 000～6 000 lx條件下振蕩培養10 d(光周期同上)。取適量培養液和濾膜過濾，置于105 ℃烘至恒重，稱干重，計算1 L藻類的干重即為該水樣的AGP，也可采用葉綠素a法測定富營養化水體中的藻量。

3.6 生物之間的捕食關系 為了讓學生更加深刻地理解微生物之間的生態關系，在教學中以輪蟲和斜生柵藻為研究對象，觀察二者之間的捕食關系。吸取輪蟲300以上，培養于10 mL的玻璃試管中，并投喂一定濃度(1.0×106～5.0×106cells/mL)的藻類食物，培養共持續10 h。培養過程中，每隔2、4、6、8 h抽樣計數各試管內輪蟲和藻細胞密度，繪制密度隨時間變化曲線。通過實驗驗證2種微生物之間的捕食關系，為富營養化水體的生態治理奠定理論基礎。

4 教學效果和展望

輪蟲具有繁殖快速、培養容易和成本低廉的特點，是理想的環境微生物實驗材料。圍繞輪蟲開展相關環境生物學實驗是安徽工程大學環境工程微生物學實驗教學的一項創新。通過往屆教學效果的比較，發現相對傳統的實驗教學，新開設的以輪蟲為中心的實驗體系既能提高學生的實驗基礎技能(顯微鏡的使用、微生物的形態觀察、計數等)，又能提高學生的專業知識(有害污染物毒性、水體富營養評價和生態鏈關系)；另一方面，輪蟲是安徽工程大學環境學科研究方向之一，在完成教學計劃的同時，讓更多的本科生參與教師的科學研究，整合了教學和科研資源，達到了教、學、研相互促進的良性互動效果。

在未來強化學科排名為導向的辦學模式中，緊緊圍繞環境學科開設環境專業基礎課，有利于環境學科的發展，有利于環境專業人才的培養。因此，在環境工程微生物學實驗改革方面，應進一步拓展包括輪蟲在內的其他環境常用微生物的應用范圍，完善其在基礎教學中的應用。在基礎學科教學改革中，輪蟲在環境工程微生物學實驗中的應用和經驗值得借鑒。

[1] 黃祥飛，席貽龍，諸葛燕.輪蟲[J].生物學通報，1999(11)：10-12.

[2] 郭凱，趙文，殷守仁，等.北京官廳水庫輪蟲群落結構與水體富營養化狀況[J].湖泊科學，2010(2)：256-264.

[3] 饒利華，吳芝瑛，徐駿，等.杭州西湖輪蟲的群落結構及與水體環境因子的關系[J].湖泊科學，2013(1)：138-146.

[4] DUGGAN I C，GREEN J D，SHIEL R J.Distribution of rotifers in North Island，New Zealand，and their potential use as bioindicators of lake trophic state[J].Hydrobiologia，2001，446(1)：155-164.

[5] 耿紅.水體富營養化和藍藻對輪蟲影響的生態毒理學研究[D].武漢：中國科學院研究生院，2006.

[6] 錢方平，席貽龍，溫新利，等.湖泊富營養化對輪蟲群落結構及物種多樣性的影響[J].生物多樣性，2007(4)：344-355.

[7] 劉建康.高級水生生物學[M].北京：科學出版社，1999：205.

[8] 李飛，郭建林，張宇飛，等.淡水輪蟲土池培育技術研究及應用[J].安徽農業科學，2014，42(28)：9786-9787.

[9] 劉文娟，鄒寧，孫東紅，等.輪蟲對2種不同微藻餌料的攝食量研究[J].安徽農業科學，2008，36(33)：14558-14559.

[10] 周群英，王士芬.環境工程微生物學[M].3版.北京：高等教育出版社，2008.

[11] 胡菊香，吳生桂，陳金生，等.巢湖富營養化對輪蟲的影響研究[J].環境科學與技術，2007(12)：16-18.

[12] 鄭金秀，池仕運，李聃，等.富營養化對淺水湖泊輪蟲種群結構影響研究[J].生態環境學報，2014(12)：1964-1971.

[13] VERMA V，RICO-MARTINEZ R，KOTRA N，et al.Estimating the toxicity of ambient fine aerosols using freshwater rotiferBrachionuscalyciflorus(Rotifera：Monogononta)[J].Environmental pollution，2013，182(6)：379-384.

[14] XU X P，XI Y L，HUANG L，et al.The life-table demographic response of freshwater rotiferBrachionuscalyciflorusto multi-metal(Cu，Zn，Cd，Cr，and Mn)mixture interaction[J].Bulletin of environmental contamination & toxicology，2014，93(2)：165-170.

[15] XU X P，XI Y L，HUANG L，et al.Effects of multi-metal(Cu，Zn，Cd，Cr，and Mn)mixtures on the reproduction of freshwater rotiferBrachionuscalyciflorus[J].Bulletin of environmental contamination & toxicology，2015，95(6)：1-7.

[16] ASTM.Standard guide for acute toxicity test with the rotiferBrachionus[S].Philadelphia,PA,USA:American Society for Testing Material，2012.

[17] 章宗涉，黃祥飛.淡水浮游生物研究方法[M].北京：科學出版社，1991.

[18] USEPA.Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to freshwater and marine organisms[M].Washington，DC：U.S.Environmental Protection Agency，2002.

Application of Rotifer in Environmental Microbiology Experiment Teaching

YANG Xiao-fan1, XU Xiao-ping2

(1. College of Biological and Chemical Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu, Anhui 241000; 2. College of Civil Engineering and Architecture, Anhui Polytechnic University, Wuhu, Anhui 241000)

The environmental microbiology is a professional basic course in environmental engineering of higher education, and the experiment teaching of the course includes a large number of prokaryotic micro-organisms which give some degree of difficulty. In order to solve the problem, the micro-metazoa rotifer was selected as the test object, for its simple culture and frequent reproducing, and 6 experiments were set up combined with the teachers' scientific research. The application of rotifer, which has highlighted the professional characteristic of environmental engineering, has stimulated students’ interest and achieved remarkable teaching effect.

Rotifer; Environmental microbiology; Experiment teaching

安徽省高等教育提升計劃(TSKJ2016B016)；安徽工程大學教育教學研究項目。

楊曉凡(1978-)，男，安徽壽縣人，講師，博士，從事生態毒理與水污染治理研究。

2016-08-12

S-01

A

0517-6611(2016)28-0256-03