重組人生長激素對人胃癌MGC803細胞生長的影響

常見榮，魏練平，王榮海 ，宋禮華,

?

重組人生長激素對人胃癌MGC803細胞生長的影響

常見榮1，魏練平2，王榮海3，宋禮華1,3

目的 探究重組人生長激素(rhGH)對人胃癌MGC803細胞生長的影響。方法 采用Western blot法檢測MGC803與MKN45兩種胃癌細胞生長激素受體(GHR)蛋白的表達以及實時定量PCR(qRT-PCR)法檢測二者GHR mRNA的相對表達量。采用MTT法檢測在無血清同步24 h、3%胎牛血清(FBS)給藥培養基條件下，不同濃度rhGH作用不同時間對MGC803細胞增殖的影響。采用流式細胞術及Western blot法測定不同濃度的rhGH對MGC803細胞周期及相關信號通路節點蛋白表達的影響。結果 Western blot與qRT-PCR結果表明，MGC803細胞在蛋白以及mRNA水平都被驗證為GHR陽性表達的細胞株，具有發揮作用的生物學基礎。MTT結果表明，在含3%FBS的給藥培養基條件下，不同濃度的rhGH對MGC803細胞有促增殖作用，但不同rhGH濃度組之間差異無統計學意義。細胞周期的結果表明，與對照組比較，rhGH給藥組增殖指數(PI)升高。Western blot結果顯示，在rhGH作用下，磷酸化酪氨酸蛋白激酶2(p-JAK2)、磷酸化信號轉導和轉錄活化因子3(p-STAT3)、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)和磷酸化細胞外調節蛋白激酶(p-ERK)等信號蛋白表達上調。結論 在3% FBS培養條件下，rhGH促進MGC803細胞增殖，與激活JAK2-STAT3通路、上調下游p-AKT及p-ERK的表達有關。

重組人生長激素；胃癌；MGC803；生長激素受體；JAK-STAT3通路

臨床上，嚴重的蛋白營養不良和負氮平衡是影響腫瘤治療療效和患者生存質量的首要制約因素，也是晚期腫瘤患者的主要死亡原因，單純的營養支持并不能改善腫瘤患者的惡液質狀態。生長激素(growth hormone，GH)是由垂體分泌的合成類激素，具有促進蛋白質合成、糾正負氮平衡狀態、調節免疫功能等作用，對于臨床上腫瘤患者惡液質的改善具有重要意義。但GH作為一種生長因子能否用于腫瘤患者的治療一直存在爭議，爭議的焦點在于GH在營養支持的同時是否會促進腫瘤的增殖[1-2]，因此探討GH對腫瘤增殖的影響具有重要的意義。胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，患者往往會出現負氮平衡與惡液質狀態[3-4]，嚴重影響了胃癌患者的生存質量，該研究初步探究重組人生長激素(recombinant human growth hormone，rhGH)體外對胃癌細胞株增殖的影響，為rhGH對腫瘤增殖的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 MGC803、MKN45人胃癌細胞株購自北京醫學科學院；注射用rhGH由安徽安科生物工程(集團)股份有限公司提供；TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)與SYBRTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒(日本Takara公司)；GHR、β-actin引物由上海生工公司合成；MTT(美國Sigma公司)；RPMI-1640改良型培養基、雙抗(青鏈霉素)(美國Hyclone公司)；胎牛血清(上海生工公司)；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物研究所)；GHR單克隆抗體(英國Abcam公司)；酪氨酸蛋白激酶2(janus kinase2，JAK2)、信號轉導和轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase，AKT)、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)、磷酸化AKT、磷酸化ERK、磷酸化STAT3、磷酸化JAK2等單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；β-actin單克隆抗體(北京銳抗生物科技有限公司)；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠抗體以及預染蛋白Marker(美國Thermo公司)；實時定量PCR(qRT-PCR)儀(美國Applied Biosystems公司)；Emax Plus酶標儀、FACS Verse流式細胞儀(美國MD公司)；ChemiScope 3600 Pro化學發光成像系統(上海勤翔公司)。

1.2 方法

1.2.1 Western blot法檢測GHR的表達 正常培養MGC803與MKN45兩種細胞。待細胞生長至對數期，棄去上清液并用預冷的PBS洗去殘留培養基后，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液400 μl，冰上放置15 min充分裂解。分別用細胞刮刀收集后，轉移至干凈的離心管中，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，取上清液。利用BCA試劑盒定量檢測蛋白濃度，根據測出濃度值加入適量含DTT的上樣緩沖溶液，調整兩樣品最終蛋白濃度相等，沸水浴8 min。等體積上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，通過轉膜將膠上蛋白轉移至PVDF膜上。經過5% BSA封閉、一抗4 ℃孵育過夜，辣根過氧化酶標記的二抗孵育1.5～2 h，凝膠自動成像系統對于覆蓋ECL發光液的膜條進行掃描，最終獲得GHR以及β-actin的蛋白表達結果圖。

1.2.2 qRT-PCR法檢測細胞內GHR mRNA的表達 取正常培養的細胞，控制細胞數在一定范圍(5×106～1×107個)，加入1 ml TRIzol試劑提取細胞內總RNA。利用超微量紫外分光光度計測得RNA濃度并得到光密度(optical density，OD)值，計算OD260/OD280，純RNA的OD260/OD280范圍為1.7～2.0。根據所提取的RNA樣品濃度，利用PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒，構成適當的體系(10 μl)并逆轉錄得到cDNA，逆轉錄條件為37 ℃、15 min(反轉錄反應)，85 ℃、5 s(反轉錄酶的失活反應)。逆轉錄所得的產物作為qRT-PCR的模板，根據SYBRTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒構成總體積為20 μl的反應體系，設置MKN45組以及MGC803組，以β-actin為內參，所用引物[5-6]見表1。qRT-PCR反應條件為95 ℃、20 s，95 ℃、3 s，60 ℃、30 s，重復40個循環。溶解曲線的條件為95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。根據最終反應所得的CT值，計算出2-ΔΔCT值，從而得出兩種細胞GHR mRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR法檢測細胞內GHR mRNA的表達所用引物

1.2.3 MTT法測定細胞增殖 取對數生長期的MGC803細胞，調整細胞濃度為5×107/L，分別接種于3塊96孔板中，每孔100 μl，貼壁生長。待細胞貼壁后，傾去培養基，每孔加入200 μl無血清培養基饑餓處理。24 h后傾去無血清培養基并分別加入給藥培養基(含3% FBS)配置的終濃度為25、100、400 μg/L的rhGH 180 μl/孔。同時設置對照組，每組設6個復孔。藥物作用24、48、72 h后，分別取出96孔板，每孔加入20 μl MTT，孵育4～6 h后，緩慢吸棄上清液，每孔加150 μl DMSO 并振蕩溶解10 min，酶標儀檢測各孔OD值，波長為490 nm。相對增殖率(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。根據以上步驟，重復3次，得出不同藥物濃度、不同時間對于MGC803細胞增殖的影響。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 將對數生長期的MGC803細胞鋪于60 mm一次性無菌平皿中，貼壁生長后棄去上清液，加無血清培養基饑餓處理24 h。分為對照組以及給藥組，根據MTT結果設置給藥組rhGH濃度為100 μg/L。分別作用4、8、12、24 h后，0.25%胰酶消化收集細胞。參考試劑盒說明書進行處理，最后上機檢測。

根據以上實驗結果，得到rhGH作用效果的最佳時間，再設置不同rhGH濃度(對照組、25、100、400 μg/L)作用MGC803細胞固定時間后，0.25%胰酶消化，收取細胞，根據試劑盒操作處理，上機檢測。以上同法重復3次。采用modifit軟件進行細胞DNA含量分析，得到藥物作用時間以及濃度對于MGC803細胞增殖指數(PI)的影響，PI(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.2.5 Western blot法檢測rhGH作用后細胞內相關信號通路節點蛋白的表達 取處于對數生長期的MGC803細胞鋪于4個100 mm一次性培養皿中，待細胞貼壁后傾去上清液，加無血清培養基饑餓處理24 h。待無血清饑餓結束，每皿加入9 ml含藥培養基(含3% FBS)，rhGH終濃度分別為 0、25、100、400 μg/L。給藥作用半小時后棄去上清液，裂解細胞收取蛋白，處理步驟與1.2.1方法相同。檢測的信號蛋白有JAK2、STAT3、AKT、ERK、p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、p-ERK以及β-actin，利用Quantity One 軟件對所測蛋白的灰度值進行分析。

2 結果

2.1 Western blot法檢測兩種細胞GHR的表達 MGC803與MKN45的GHR表達見圖1，MKN45細胞GHR表達呈陰性，而MGC803細胞GHR則呈陽性表達。

圖1 MKN45與MGC803細胞GHR的表達

2.2 qRT-PCR法檢測兩種細胞內GHR mRNA的表達 MKN45與MGC803細胞GHR mRNA相對表達量結果見圖2。MGC803細胞GHR mRNA 與MKN45細胞比較，差異有統計學意義(t=24.076，P<0.05)。

圖2 MKN45與MGC803細胞GHR mRNA相對表達量與MKN45比較：*P<0.05

綜合以上兩種方法對于GHR以及GHR mRNA的檢測，Western blot結果顯示MKN45細胞呈GHR陰性表達，且qRT-PCR 結果也顯示其GHR mRNA明顯低于MGC803細胞，說明MGC803是GHR陽性表達的細胞株。故此后續實驗主要研究對象為MGC803細胞。

2.3 MTT法檢測rhGH對MGC803細胞增殖的影響

2.3.1 rhGH作用時間對MGC803細胞增殖的影響 在3% FBS培養條件下，與對照組(0.428±0.034、0.945±0.058、1.335±0.069)比較，濃度為100 μg/L的rhGH作用24 h(0.492±0.035)、48 h(1.127±0.069)以及72 h(1.514±0.046)對MGC803細胞均有促進增殖作用，且差異有統計學意義(t=3.629、5.726、6.074，P﹤0.05)。與同時間對照組比較，24 h時給藥組相對增殖率為114.9%(t=4.847，P<0.05)，48 h以及72 h給藥組相對增殖率分別119.2%(t=8.390,P<0.05)以及113.4%(t=6.421，P<0.05)，差異均有統計學意義，見圖3、4。

圖3 對照組與100 μg/L rhGH作用MGC803細胞不同時間OD值變化與同時間對照組比較：*P<0.05

圖4 100 μg/L rhGH作用MGC803細胞不同時間的相對增殖率與同時間對照組比較：*P<0.05

2.3.2 不同濃度rhGH對MGC803細胞增殖的影響 在3% FBS培養條件下，rhGH濃度分別為25、100、400 μg/L。不同濃度rhGH分別作用MGC803細胞24、48、72 h時均表現出促進增殖的作用，給藥組OD值與對照組比較差異均有統計學意義(F=6.836、13.577、18.273，P<0.05)，但同一時間各濃度組之間差異無統計學意義，見圖5。

2.4 流式細胞儀檢測rhGH對MGC803細胞周期的影響

表2 rhGH作用MGC803細胞不同時間周期變化及增殖指數

與同時間對照組比較：*P<0.05

圖5 不同濃度rhGH對MGC803細胞增殖的影響與對照組比較：*P<0.05

2.4.1 rhGH作用不同時間對MGC803細胞周期的影響 rhGH對于MGC803細胞的影響隨著時間的變化而呈現不同的作用。結果顯示，rhGH作用MGC803細胞4 h時，給藥組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)?？赏茢?，rhGH作用MGC803細胞4 h可能為最優條件，見表2。

2.4.2 不同濃度rhGH作用MGC803細胞4 h對細胞周期的影響 依據公式可算得PI值，與對照組比較，給藥組PI有不同程度的增加。對照組PI為39.83%，給藥組PI依次為45.95%、46.64%、42.83%，說明rhGH促使MGC803細胞由G0/G1期向S期、G2/M期轉變，促進細胞增殖，見圖6。

2.5 Western blot法檢測細胞內相關信號通路蛋白表達 給藥組p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、p-ERK的表達水平均有上調，其中p-JAK2/JAK2低濃度組與對照組差異無統計學意義，隨著rhGH給藥濃度的增加，給藥組與對照組灰度比差異有統計學意義(F=13.407，P<0.05)，同時給藥組p-STAT3/STAT3和p-AKT/AKT與對照組比較均有不同程度上調，且差異有統計學意義(F=9.050、9.936，P<0.05)，但給藥組間差異無統計學意義。給藥組p-ERK/ERK與對照組比較蛋白水平明顯上調，差異有統計學意義(F=3.727E3，P<0.01)。見圖7。

3 討論

rhGH是否促進腫瘤的增殖是介入腫瘤治療的關鍵因素。從分子機制看，細胞膜表面GHR的表達是GH影響腫瘤細胞增殖的生物學基礎[7-10]。最初選取了兩株人胃癌細胞株作為研究對象，探討二者GHR的表達情況。Western blot結果顯示，MGC803呈GHR陽性表達，而MKN45則呈陰性。qRT-PCR結果顯示，人胃癌MGC803細胞株GHR mRNA相對表達量明顯多于人胃癌MKN45細胞株，差異有統計學意義。說明rhGH確實存在促進MGC803細胞增殖的生物學基礎。由于體外rhGH發揮作用的第一步是與GHR結合[11]，故此后續實驗主要研究對象為MGC803細胞。

圖6 不同濃度rhGH對MGC803細胞周期的影響

圖7 不同濃度rhGH作用MGC803細胞相關信號通路蛋白表達

A：對照組；B：rhGH 25 μg/L；C：rhGH 100 μg/L；D：rhGH 400 μg/L；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

MTT實驗表明，3% FBS培養條件下(為降低血清生長因子對實驗的影響)，rhGH對MGC803的增殖有促進作用(P<0.05)。進一步研究顯示，在無血清饑餓處理24 h后，rhGH能促進MGC803細胞由G0/G1期向S期、G2/M期轉變。Western blot結果顯示rhGH能不同程度上調MGC803細胞p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、p-ERK的表達水平。其中p-AKT與p-ERK是JAK2-STAT3信號通路的下游信號蛋白，p-ERK被認為可以從細胞質入核，介導諸多基因轉錄，從而促進細胞增殖[12]。而AKT是PI3K-AKT-mTOR經典信號通路的重要組成部分，p-AKT的上調能夠激發下游蛋白，引發一系列細胞增殖以及抑制細胞凋亡的反應[13]。由此可見，本研究中rhGH在低血清水平下，可能通過與GHR結合，激活JAK2-STAT3信號通路，進一步上調p-AKT與p-ERK，從而促進GHR陽性表達的MGC803細胞的增殖與細胞周期的改變。

實驗設置3個rhGH給藥濃度，以生理濃度25 μg/L為低濃度，臨床藥理濃度100 μg/L為中濃度，400 μg/L為高濃度[14]。在MTT實驗及流式細胞周期實驗中，均沒有表現出濃度依賴性，3種濃度的rhGH對下游信號蛋白磷酸化水平的調節差異亦無統計學意義。與對照組比較，rhGH能夠促進MGC803細胞株的增殖(P<0.05)，但與生理濃度(25 μg/L)比較，rhGH臨床藥理濃度(100 μg/L)及高濃度400 μg/L未表現出增殖差異。推測這與細胞內GHR受體的表達量以及GH飽和有關，研究[15]顯示，2分子的GHR結合1分子的GH形成二聚化，是GH發揮生物學功能的基礎，而當GH濃度超出細胞內GHR所能結合的范圍，1個受體分子與1個GH分子結合，將阻止受體二聚化，從而不能發揮信息傳遞的功能。

綜上所述，rhGH在體外對MGC803細胞的生長有促進作用。此外，與體外研究相比，rhGH在體內對腫瘤細胞增殖的影響更加復雜。rhGH在體內不僅可以通過與腫瘤表面GHR結合，直接或間接通過IGF-1影響腫瘤增殖，也可以與肝臟GHR結合，通過循環IGF-1作用于腫瘤細胞[16]。而rhGH作用下機體營養與免疫的改善對腫瘤的增殖也會產生影響。rhGH是否能應用于腫瘤患者以及對MGC803細胞的體內影響受多種因素調控而可能呈現不同的反應，將通過動物模型進一步研究。

[1] Couch M E, Dittus K, Toth M J, et al. Cancer cachexia update in head and neck cancer: Pathophysiology and treatment[J]. Head Neck,2015,37(7): 1057-72.

[2] Clayton P E, Banerjee I, Murray P G, et al. Growth hormone, the insulin-like growth factor axis, insulin and cancer risk[J]. Nat Rev Endocrinol,2011,7(1): 11-24.

[3] Li G, Hu Y, Liu H. Current status of randomized controlled trials for laparoscopic gastric surgery for gastric cancer in China[J]. Asian J Endosc Surg, 2015, 8(3):263-7.

[4] Huhmann M B, Cunningham R S. Importance of nutritional screening in treatment of cancer-related weight loss[J]. Lancet Oncol, 2005, 6(5): 334-43.

[5] Nakonechnaya A O, Jefferson H S, Chen X, et al. Differential effects of exogenous and autocrine growth hormone on LNCaP prostate cancer cell proliferation and survival[J]. J Cell Biochem,2013, 114(6): 1322-35.

[6] Hashemi A, Roohvand F, Ghahremani M H. Selection of valid reference genes for expression studies of hepatic cell lines under IFN-α treatment[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 426(4): 649-53.

[7] Franklin S L, Geffner M E. Growth hormone: the expansion of available products and indications[J]. Pediatr Clin North Am,2011,58(5): 1141-65.

[8] Kenth G, Mergelas J A, Goodyer C G. Developmental changes in the human GH receptor and its signal transduction pathways[J]. J Endocrinol,2008,198(1): 71-82.

[9] Li S, Hou G, Wang Y, et al. Influence of recombinant human growth hormone (rhGH) on proliferation of hepatocellular carcino-ma cells with positive and negative growth hormone receptorsinvitro[J]. Tumori, 2010,96(2): 282-8.

[10]Wu W Y, Li J, Wu Z S, et al. STAT3 activation in monocytes accelerates liver cancer progression[J]. BMC Cancer,2011,11: 506.

[11]Lin Y, Li S, Cao P, et al. The effects of recombinant human GH on promoting tumor growth depend on the expression of GH receptorinvivo[J]. J Endocrinol,2011, 211(3): 249-56.

[12]Ehrenfeld P, Conejeros I, Pavicic M F, et al. Activation of kinin B1 receptor increases the release of metalloproteases-2 and -9 from both estrogen-sensitive and -insensitive breast cancer cells[J]. Cancer Lett,2011,301(1): 106-18.

[13]Pal I, Mandal M. PI3K and Akt as molecular targets for cancer therapy: current clinical outcomes[J]. Acta Pharmacol Sin,2012,33(12): 1441-58.

[14]Nuoffer J M, Flck C, Deladoy J, et al. Regulation of human GH receptor gene transcription by 20 and 22 kDa GH in a human hepatoma cell line[J]. J Endocrinol,2000, 165(2): 313-20.

[15]Wells J A, de Vos A M. Hematopoietic receptor complexes[J]. Annu Rev Biochem, 1996,65: 609-34.

[16]Waters M J, Hoang H N, Fairlie D P, et al. New insights into growth hormone action[J]. J Mol Endocrinol,2006,36(1):1-7.

Effect of recombinant human growth hormone on the growth of gastric cancer MGC803 cells

Chang Jianrong1, Wei Lianping2,Wang Ronghai3,et al

(1DeptofBiochemistryandMolecularBiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032；2SchoolofLifeScience,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230061;3AnhuiAnkeBiotechnology(Group)Co.,Ltd,Hefei230000)

Objective To explore the effect of recombinant human growth hormone (rhGH) on the growth of human gastric cancer MGC803 cells. Methods Western blot was performed to detect the expressions of growth hormone receptor (GHR) protein of MGC803 and MKN45 cells, and the relative expressions of GHR mRNA of the two kinds of gastric cancer cells were evaluated by qRT-PCR. Under the condition of serum starvation for 24 hours and incubated in culture media with 3% FBS, MTT assay was used to detect the proliferation of MGC803 cells treated with different concentrations of rhGH for different times. Flow cytometry (FCM) was used to detect the effect of rhGH on MGC803 cell cycle. The expressions of related signal pathway proteins were measured by Western blot. Results The results of Western blot and qRT-PCR showed that MGC803 cells were verified as the cell strains of GHR positive expression in the level of protein and mRNA. MTT assay revealed that rhGH could promote the proliferation of MGC803 cells but the difference among different rhGH concentration groups was not statistically significant. FCM analysis showed that rhGH could improve the proliferation index (PI) of MGC803 cells. Western blot suggested that rhGH could upregulate the expressions of p-JAK2, p-STAT3, p-AKT and p-ERK. Conclusion rhGH may activate the JAK/STAT3 signal pathway and thus upregulate the downstream p-AKT and p-ERK levels to promote the prolifetation of MGC803 cells.

rhGH；gastric cancer；MGC803；growth hormone receptor；JAK-STAT3 pathway

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.004.html

2016-05-30接收

1安徽醫科大學生物化學與分子生物學教研室，合肥 230032

2安徽農業大學生命科學學院，合肥 230061

3安徽安科生物工程(集團)股份有限公司，合肥 230000

常見榮，女，碩士研究生；

宋禮華，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：Sonlh@ankebio.com

R 735.2；R 341；R 969

A

1000-1492(2016)10-1411-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.004