丙戊酸鈉對APP/PS1轉基因小鼠腦內海馬區老年斑形成的影響

胡江平 蔡克瑞 金在順 金花淑 李凱軍

(牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011)

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丙戊酸鈉對APP/PS1轉基因小鼠腦內海馬區老年斑形成的影響

胡江平 蔡克瑞 金在順 金花淑 李凱軍

(牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011)

目的 研究丙戊酸鈉(VPA) 對APP/PS1轉基因小鼠腦內海馬區老年斑(SP)形成的影響。方法 APP/PS1轉基因小鼠隨機分為對照組和VPA治療組，VPA治療后應用免疫組化技術檢測APP/PS1轉基因小鼠腦內海馬區SP的數量及大小。ELISA測定腦組織β淀粉樣蛋白(Aβ)的含量變化。結果 VPA治療組小鼠海馬區域出現的陽性SP數目與對照組相比分別顯著減少65%，斑塊沉積也分別由0.65%降到0.22%(P<0.01)。ELISA結果顯示，VPA治療組小鼠腦內可溶性Aβ的水平(75 pg/mg)較對照組明顯下降(92 pg/ml，P<0.05)。結論 VPA可以減少APP/PS1轉基因小鼠腦內SP的形成，抑制Aβ的生成。

丙戊酸鈉；阿爾茨海默病；APP/PS1轉基因小鼠；β淀粉樣蛋白

阿爾茨海默病(AD)的病理特征為細胞外β淀粉樣蛋白(Aβ) 沉積形成的老年斑(SP)、細胞內磷酸化tau蛋白聚合形成的神經纖維纏結(NFTs) 和選擇性膽堿能神經元在學習和記憶相關的腦區的缺失〔1～3〕。抑制老年斑的形成是治療AD的重要途徑之一。丙戊酸鈉(VPA)是廣泛用于治療癲癇和情感障礙的抗驚厥藥物和情緒穩定劑。VPA作為治療雙相情感障礙的主要藥物，能有效控制患者的躁狂和抑郁癥狀，與鋰鹽、卡瑪西平一起作為情緒穩定劑。VPA可能的作用機制主要包括阻止神經細胞凋亡，通過增加神經發生和刺激星形膠質細胞釋放神經營養因子保護神經元等〔4〕。本文探討VPA對APP/PS1轉基因小鼠AD病理改變的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 APP/PS1 (APPswe/PSEN1dE9) 轉基因小鼠購自美國Jackson實驗室，通過常規喂養，繁殖后經PCR進行基因型鑒定，鑒定后的轉基因小鼠用于實驗。小鼠抗Aβ抗體 (Sigma)，小鼠抗GAPDH抗體 (Kangchen)，免疫組織化學SP試劑盒 (福州邁新生物技術開發有限公司)，ELISA試劑盒 (Keregen)。紫外分光光度計，電子天平，水平搖床，Leica石蠟切片機，Olympus光學顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 20周齡APP/PS1轉基因小鼠隨機分為對照組和VPA治療組，每組6只。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，VPA治療組小鼠給予50 mg/kg VPA腹腔注射，1次/d，連續12 w。

1.2.2 樣本處理 APP/PS1 (APPswe/PSEN1dE9) 轉基因小鼠購自美國Jackson實驗室，通過常規喂養 (22℃～25℃，50%濕度，12 h光照循環)，繁殖后經PCR進行基因型鑒定，鑒定后的小鼠用于實驗。將20周齡的APP/PS1轉基因小鼠隨機分為對照組和VPA治療組。VPA治療組小鼠腹腔注射VPA (50 mg/kg)，1次/d，對照組小鼠給予等量的生理鹽水。12 w后，小鼠經麻醉處死取材，腦組織兩側半球分開，右側腦組織于4%多聚甲醛中固定后石蠟包埋，用于免疫組化分析，左側腦組織-80℃低溫冷凍保存，用于生化檢測、ELISA分析等。

1.2.3 免疫組織化學染色 腦組織石蠟切片經二甲苯脫蠟，PBS溶液沖洗3次；微波煮沸修復抗原，自然冷卻后PBS溶液沖洗3次；山羊血清室溫孵育1 h，滴加小鼠抗-Aβ抗體 (1∶5 000)，4℃孵育過夜；PBS溶液沖洗3次后滴加生物素-山羊抗小鼠IgG，室溫孵育2 h，PBS溶液沖洗3次，滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫孵育1 h；PBS溶液漂洗后DAB顯色，用蒸餾水沖洗終止反應；蘇木素復染，常規梯度脫水、透明、封片保存。使用Image-Pro Plus軟件測量海馬內SP數量及斑塊沉積，進行統計學分析。

1.2.4 酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測Aβ1～40水平 Aβ1～40含量通過ELISA試劑盒測定，操作按照說明書進行。腦組織超聲粉碎，離心后取上清液；用標本稀釋液稀釋后，每孔分別加入標準品或樣品50 μl，加入50 μl生物素標記的抗體，震蕩混勻，37℃溫育1 h；去除孔內液體，用洗滌液洗滌3次；每孔加入80 μl的親和鏈霉素-HRP，震蕩混勻，37℃溫育30 min；去除孔內液體，用洗滌液洗滌3次；每孔加入底物A、B各50 μl，震蕩混勻，室溫孵育30 min，37℃孵育10 min，避光；取出酶標板，加入50 μl終止液，酶標儀450 nm波長測OD值，通過標準曲線計算Aβ1～40含量。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 老年SP數目與斑塊沉積 由于APP/PS1轉基因小鼠的顯著特點是出現明顯的記憶缺失，并且腦內SP的數量隨著年齡的增加而增多，這與AD患者的神經病理過程基本一致。本實驗所用的20周齡APP/PS1轉基因小鼠處于SP形成早期，給藥12 w后，應用免疫組織化學技術觀察各組小鼠腦內SP的數量及大小，在大腦海馬等部位的陽性SP呈棕黃色(圖1)。VPA治療組小鼠的大腦海馬區域出現的陽性SP數目與對照組相比均顯著減少65%，斑塊沉積由0.65%降到0.22%，兩組差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 腦組織Aβ含量 VPA治療組小鼠腦內可溶性Aβ的水平為75 pg/ml，較對照組(92 pg/mg)明顯下降(P<0.05)。

圖1 兩組小鼠腦內SP形成(DAB，×200)

3 討 論

目前認為多種機制參與了AD的病理過程，如Aβ毒性、tau蛋白異常修飾等〔5〕。Aβ的產生和代謝不平衡，長期累積會導致Aβ的沉積和SP的形成，引起神經元損傷和認知功能衰退，在這個過程中并發或單獨發生NFTs，最終導致神經元變性和死亡。Aβ在AD發病過程中起到了中心和共同通道的作用，所以針對其進行治療是防治AD發生的一個重要措施。

VPA是廣泛用于治療癲癇和雙向情感障礙的藥物，其安全性和耐受性測試已經通過臨床測試〔6〕，但是對常見的退行性疾病的治療還需要進一步評估其有效性。VPA可以介導小膠質細胞對Aβ的清除作用，可能是一種潛在的治療AD的藥物。VPA通過增加生長相關蛋白的表達，促進軸突生長，延長細胞的壽命以及減少腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6產生，抑制核因子(NF)-κB激活，發揮抗炎作用，對抗炎癥誘導的神經細胞損傷，抑制離子通道、增強γ-氨基丁酸傳遞，調節GSK3活性，激活細胞外信號調節激酶。VPA減少了小鼠腦內SP的形成，抑制了Aβ沉積很可能通過抑制GSK3β進而抑制了γ-分泌酶的作用〔7〕。Liao等〔8〕研究表明，人β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)表達的增加將導致腦內Aβ的異常增多與聚集，對AD的病理過程有顯著影響。因此，抑制BACE1的表達是降低Aβ的產生及治療AD的一個有效靶點。APP/PS1雙轉基因小鼠攜帶有突變APP和PS1基因，能夠模擬AD患者腦內的一些主要的神經病理過程〔9〕，是目前研究AD較好的動物模型。通過對APP/PS1轉基因小鼠的研究發現，VPA對轉基因小鼠腦內Aβ的生成及SP的形成具有抑制作用，與以往的研究結果一致〔10〕，顯著減少了小鼠腦內SP的形成和Aβ的分泌。本研究表明VPA減少Aβ的生成，進而抑制SP的形成。

1 Zhang LH，Wang X，Zheng ZH，etal.Altered expression and distribution of zinc transporters in APP/PS1 transgenic mouse brain〔J〕.Neurobiol Aging，2010；31(1)：74-87.

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3 Smith IF，Hitt B，Green KN，etal.Enhanced caffeine-induced Ca2+release in the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurochem，2005；94(6)：1711-8.

4 Qing H，He G，Ly PT，etal.Valproic acid inhibits A beta production，neuritic plaque formation，and behavioral deficits in Alzheimer′s disease mouse models〔J〕.J Exp Med，2008；205(12)：2781-9.

5 李凱軍，胡江平.雌二醇對岡田酸誘導的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(2):412-3.

6 Profenno LA，Jakimovich L，Holt CJ，etal.A randomized，double-blind，placebo-controlled pilot trial of safety and tolerability of two doses of divalproex sodium in outpatients with probable Alzheimer′s disease〔J〕.Curr Alzheimer Res，2005；2(5)：553-8.

7 Smith AM，Gibbons HM，Dragunow M.Valproic acid enhances microglial phagocytosis of amyloid-〔beta〕1-42〔J〕.Neuroscience，2010；169(1)：505-15.

8 Liao W，Jin G，Zhao M，etal.The effect of genistein on the content and activity of α-and β-secretase and protein kinase C in Aβ-injured hippocampal neurons〔J〕.Basic Clin Pharmacol Toxicol,2013;112(3)：182-5.

9 Koivisto H，Grimm MO，Rothhaar TL，etal.Special lipid-based diets alleviate cognitive deficits in the APPswe/PS1dE9 transgenic mouse model of Alzheimer′s disease independent of brain amyloid deposition〔J〕.J Nutr Biochem,2014；25(2)：157-69.

10 Hu JP，Xie JW，Wang CY，etal.Valproate reduces tau phosphorylation via cyclin-dependent kinase 5 and glycogen synthase kinase 3 signaling pathways〔J〕.Brain Res Bull,2011；85(3-4)：194-200.

〔2015-03-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

黑龍江省教育廳海外學人項目(No.1153h16)；黑龍江省教育廳研究生創新科研項目(No.YJSCX2011-298HLJ)

李凱軍(1979-)，男，碩士，講師，主要從事阿爾茨海默病研究。

胡江平(1979-)，女，講師，博士，主要從事阿爾茨海默病研究。

R322.81

A

1005-9202(2016)20-4943-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.002