香煙煙霧提取物對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移的影響

屈寶澤 游 陸 劉奇峰

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

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香煙煙霧提取物對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移的影響

屈寶澤 游 陸 劉奇峰

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

目的 探討香煙煙霧提取物(CSE) 對(duì)大鼠A10主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)遷移的影響及可能機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)大鼠VSMC，并分為空白對(duì)照組及CSE組，其中CSE組給予5%CSE處理24 h，應(yīng)用Transwell方法檢測(cè)兩組VSMC的遷移能力；應(yīng)用RT-PCR 和 Western 印跡方法檢測(cè)兩組骨橋蛋白(OPN)表達(dá)水平。結(jié)果 CSE組VSMC遷移能力較空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)；同時(shí)CSE組OPN mRNA及蛋白表達(dá)均較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。結(jié)論 CSE能夠促進(jìn)大鼠VSMC的遷移，其機(jī)制可能與上調(diào)OPN表達(dá)有關(guān)。

香煙煙霧提取物；血管平滑肌細(xì)胞；遷移；骨橋蛋白

血管重塑是高血壓、冠脈介入治療術(shù)后再狹窄及動(dòng)脈硬化等血管相關(guān)疾病的共同病理生理過程之一，而血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)向內(nèi)膜下增殖與遷移是血管重塑的重要病理基礎(chǔ)〔1～3〕。吸煙是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等多種血管相關(guān)疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，參與了血管重塑的發(fā)生發(fā)展過程，但其機(jī)制尚有待研究。骨橋蛋白(OPN)是一種分泌型的糖基化磷蛋白，應(yīng)用抗OPN抗體可以抑制VSMC的表型轉(zhuǎn)化、遷移和增殖。本研究擬應(yīng)用香煙煙霧提取物(CSE)對(duì)大鼠 VSMC進(jìn)行處理，觀察其對(duì)大鼠 VSMC 遷移的影響，并檢測(cè)OPN表達(dá)水平的變化，對(duì)CSE參與血管重塑的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)所需香煙(美國(guó)肯塔基大學(xué)煙草健康研究所煙草研究用香煙 3R4F)；胎牛血清(杭州四季青公司)；大鼠A10主動(dòng)脈VSMC株(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；OPN、α-tubulin兔抗大鼠多克隆抗體(Santa Cruz)；Transwell試劑盒(Corning)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) VSMC采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%的胎牛血清)，細(xì)胞在5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2～3天換液一次。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，予以傳代。

1.3 細(xì)胞分組及方法 培養(yǎng)的VSMC分為2組：①空白對(duì)照組；②CSE組 (終濃度為5%CSE刺激24 h)。Transwell 法檢測(cè)VSMC的遷移能力。應(yīng)用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，應(yīng)用10%胎牛血清無(wú)抗生素DMEM終止消化，離心800 r/min，5 min，棄上清，無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM 1 ml重懸細(xì)胞(5×105/ml)。將含10%胎牛血清的 DMEM 600 μl加入到Transwell下室中，并將上室置于下室中，同時(shí)吸取100 μl的細(xì)胞懸液加入到上室。在條件為37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育24 h后，取出上室，用沾有PBS液的棉簽將上室中的細(xì)胞擦掉，用4℃下預(yù)冷后的95%酒精將遷移至小室濾膜外表面的細(xì)胞固定30 min后，再用蘇木素染劑染色15 min，置于1%的鹽酸酒精下分化3 s。用自來(lái)水沖洗15 min。過夜晾干上室濾膜，用刀片將其切下，滴加半滴中性樹膠于載玻片上，將下室面朝上并平鋪于載玻片上，再將半滴中性樹膠滴加到膜上，最后用蓋玻片將封片保存。于光學(xué)顯微鏡下照相，并計(jì)數(shù)遷移到下室面濾膜的VSMC，計(jì)數(shù)5個(gè)HP視野(×200)的穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)，計(jì)算VSMC遷移抑制率。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)OPN mRNA的表達(dá) 94 ℃ 5 min ；93 ℃ 變性30 s，OPN 54 ℃ ，GAPDH 56℃退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，共 30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取 5 μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析(120 V，45 min)，DNAgreen染色，凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)掃描成像，以GAPDH為內(nèi)參。OPN上游引物5′-GCTGAAGCCTGACCCATCT-3′ ，下游引物5′-TCCCGTTGCTGTCCTGAT-3′； GAPDH上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.5 Western 印跡檢測(cè)OPN蛋白表達(dá) 加入RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1 mmol/L PMSF，0.1 mmol/L，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，NaVO4，10 mg/ml aprotinin，10 mg/ml LeuPePtin)200 μl裂解細(xì)胞，將蛋白濃度調(diào)至5 μg/μl。以每孔50 μg 的含量加樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)電泳分離。轉(zhuǎn)膜于PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入1∶500稀釋的OPN兔抗大鼠多克隆抗體，α-tubulin兔抗大鼠多克隆抗體4℃孵育過夜。TTBS洗膜 5 min×3，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，TTBS洗膜5 min×2，TBS洗膜5 min×1，加DAB液顯色5～10 min。凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行LSD方法。

2 結(jié) 果

2.1 CSE對(duì)VSMC遷移的影響 與空白對(duì)照組相比，CSE組VSMC的遷移能力明顯增強(qiáng)(P< 0.01)。見圖1。

圖1 CSE對(duì)VSMC遷移的影響(×200)

2.2 CSE對(duì)VSMC中OPN mRNA表達(dá)的影響 CSE組OPN mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高(P< 0.01)。見圖2。

圖2 OPN mRNA表達(dá)水平

2.3 CSE對(duì)VSMC中OPN蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，CSE組OPN蛋白的表達(dá)明顯升高(P< 0.01)。見圖3。

圖3 OPN 蛋白表達(dá)水平

3 討 論

隨著競(jìng)爭(zhēng)壓力的不斷增加和飲食生活習(xí)慣的改變，高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管支架術(shù)后再狹窄等血管相關(guān)疾病已經(jīng)愈來(lái)愈嚴(yán)重地威脅著人類的健康。血管相關(guān)疾病受多種危險(xiǎn)因素的相互影響，其中包括年齡、性別、遺傳因素、糖尿病、脂代謝紊亂、吸煙等，其中吸煙被公認(rèn)為是此類疾病的主要危險(xiǎn)因素〔4,5〕。近年來(lái)，吸煙與血管相關(guān)疾病的相關(guān)性研究已經(jīng)越來(lái)越引起人們的重視，但其相關(guān)機(jī)制仍未完全明確。

血管重塑是血管相關(guān)疾病的共同病理生理過程。血管重塑是指血管壁在局部生長(zhǎng)因子、血管活性物質(zhì)及血流動(dòng)力學(xué)等的共同作用下，管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主動(dòng)過程，其主要特征是內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、VSMC的增殖和遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積。其中，血管中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜下遷移與增殖是血管重塑的主要病理基礎(chǔ)之一。

隨著對(duì)吸煙與血管相關(guān)機(jī)制研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)吸煙可促進(jìn)VSMC增殖。有學(xué)者報(bào)道其可能與吸煙引起血管活性因子如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的大量釋放有關(guān)〔6～8〕，其機(jī)制可能與有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)等信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)〔9〕。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于吸煙對(duì)VSMC遷移影響的相關(guān)研究尚少見。本研

究表明CSE能夠顯著促進(jìn)VSMC的遷移，并進(jìn)而介導(dǎo)血管重塑。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)的不同，將VSMC分為收縮型和合成型，生理狀態(tài)下的VSMC呈收縮表型。而VSMC增殖、遷移的必要條件為VSMC由收縮表型轉(zhuǎn)換為合成表型。OPN是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，參與了骨代謝、炎癥、腫瘤生長(zhǎng)及免疫代謝等多種生命現(xiàn)象〔10～12〕。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)血管受損后其新生內(nèi)膜中的OPN表達(dá)水平顯著上調(diào)〔13〕。因此，OPN被認(rèn)為是血管重塑過程中重要的始動(dòng)因素。本實(shí)驗(yàn)表明CSE可通過上調(diào)OPN表達(dá)從而促進(jìn)VSMC的遷移。

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〔2015-04-15修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院科技啟動(dòng)基金項(xiàng)目(FYK201207)

劉奇峰(1980-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事冠心病的病理生理基礎(chǔ)研究。

屈寶澤(1971-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病的臨床防治研究。

R543.12

A

1005-9202(2016)20-4971-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.013