氯沙坦逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用及機(jī)制

于 敏 于杜娟

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 吉林 132011)

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氯沙坦逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用及機(jī)制

于 敏 于杜娟1

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 吉林 132011)

目的 研究氯沙坦對(duì)心室重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)作用及分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法 異丙腎上腺素(Iso)誘導(dǎo)心室重構(gòu)(VR)模型，觀察氯沙坦對(duì)VR影響；通過(guò)HE染色、Masson特染、透射電鏡、免疫組織化學(xué)染色和Western印跡方法觀察氯沙坦對(duì)心肌形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1及磷酸化蛋白激酶Cα(p-PKCα)表達(dá)的影響。結(jié)果 Iso能顯著升高心臟重量(HW)/體重(BW)、VMI、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、右室舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)、左室收縮末期右室后壁厚度(LVPWs)、心肌纖維直徑(MFD)，氯沙坦通過(guò)降低上述各指標(biāo)對(duì)抗Iso誘導(dǎo)的VR；Iso能升高尾動(dòng)脈血壓，降低心室功能指標(biāo)射血分?jǐn)?shù)(EF) 和短軸縮短速率(FS)；氯沙坦能降低尾動(dòng)脈血壓，提高EF和FS水平，從而減輕VR。結(jié)論 Iso通過(guò)提高p-PKCα和TGF-β1的表達(dá)誘導(dǎo)VR，氯沙坦通過(guò)抑制p-PKCα和TGF-β1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)VR。

心室重構(gòu)；氯沙坦；磷酸化蛋白酶C；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

心室重構(gòu)(VR)的主要病理學(xué)改變包括心肌細(xì)胞的反應(yīng)性變化和心肌間質(zhì)細(xì)胞的纖維化兩部分，抑制腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAAS)有助于VR的逆轉(zhuǎn)〔1〕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)控因子，由心肌細(xì)胞在壓力超負(fù)荷刺激下所產(chǎn)生并與膜受體結(jié)合，激活第二信使如蛋白激酶C(PKC)、絲裂酶原激活的蛋白激酶(MAPK)等促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)信息的傳遞，誘導(dǎo)RNA和蛋白質(zhì)合成，從而導(dǎo)致心肌肥厚〔2，3〕。PKC是體內(nèi)廣泛存在的一大類(lèi)蘇/絲氨酸激酶家族〔4〕，過(guò)度激活的PKC可導(dǎo)致心肌肥厚的發(fā)生〔5〕。

1 材料與方法

1.1 VR模型制備 Wistar大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組，模型組，氯沙坦低、中、高(5.0、10.0和20.0 mg/kg)三個(gè)劑量組。參照Rona等〔6〕方法，使用背部皮下注射異丙腎上腺素(Iso)10 d進(jìn)行造模。各給藥組第二日開(kāi)始灌胃給藥，連續(xù)14 d，造模和給藥間隔時(shí)間4 h以上。對(duì)照組背部皮下注射等量生理鹽水，模型組和對(duì)照組均用等容積蒸餾水灌胃，末次給藥后禁食24 h，于第15天處死動(dòng)物。

1.2 多普勒超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)VR大鼠心臟功能 藥物干預(yù)14 d后，使用多普勒超聲心動(dòng)圖對(duì)大鼠心臟功能進(jìn)行評(píng)估。形態(tài)學(xué)指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)及收縮末期內(nèi)徑(LVDs)，左室舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)、左室收縮末期左室后壁厚度(LVPWs)。收縮功能指標(biāo)包括射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)。

1.3 VR指標(biāo)檢測(cè) 大鼠稱(chēng)重處死，取出心臟，留取干凈心室，剔除其余組織，電子天平稱(chēng)取心臟重量(HW)、心室重量(VW)、左室重量(LVW)，心室/體重指數(shù)=心重(mg)/體重(g)。

1.4 心室組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取左室近心尖1/2處心肌下部組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，分別行HE染色、Masson膠原纖維特異性染色、醋酸鈾染色。光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化；10×40倍下測(cè)量大鼠心肌纖維直徑(MFD)；電鏡下檢測(cè)心肌組織超微結(jié)構(gòu)。

1.5 免疫印跡檢測(cè)磷酸化PKCα(p-PKCα)蛋白表達(dá) 提取心肌組織總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量。使用Western印跡方法檢測(cè)p-PKCα蛋白表達(dá)。

1.6 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)左室TGF-β1蛋白表達(dá) 給藥結(jié)束時(shí)于左心室赤道面橫切，甲醛固定，石蠟包埋切片，切片厚度4 μm，Envision法檢測(cè)大鼠心臟組織TGF-β1(1∶100)表達(dá)。陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色細(xì)密顆粒，陰性對(duì)照用PBS取代一抗染色為陰性。應(yīng)用全自動(dòng)圖像分析儀，在每組隨機(jī)選擇4～6個(gè)高倍視野自動(dòng)計(jì)數(shù)100個(gè)左右的細(xì)胞，用Media Cybernetics公司的Image-ProPlus 5.0圖像分析軟件分析各組TGF-β1在心肌組織中表達(dá)的平均光密度值。單位面積陽(yáng)性表達(dá)積分光密度=積分光密度/視野面積×100%。TGF-β1陽(yáng)性反應(yīng)為黃色至棕黃色顆粒，定位于胞核、近細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)處。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用直線相關(guān)分析評(píng)估兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 氯沙坦可減輕Iso誘導(dǎo)大鼠VR病理學(xué)改變 對(duì)照組心肌肌纖維完整，排列整齊，染色均勻一致(圖1A)；Iso模型組心肌肌纖維斷裂、缺損，排列紊亂，心肌內(nèi)膜下見(jiàn)大片壞死灶，局限或廣泛呈片狀分布，嚴(yán)重者相融合，心室壁全層均被累及，壞死處心肌成纖維細(xì)胞增生明顯(圖1B)；氯沙坦干預(yù)組心肌肌纖維損傷較Iso模型組明顯減輕，呈片狀(圖1C，1D)或點(diǎn)狀(圖1E)，心肌內(nèi)膜下多見(jiàn)(圖1F)。

2.2 氯沙坦可減輕Iso誘導(dǎo)大鼠VR膠原纖維增生 模型組心肌壞死灶內(nèi)纖維增生明顯，膠原纖維明顯增加；氯沙坦治療組膠原纖維受到不同程度抑制。見(jiàn)圖2。

2.3 氯沙坦可減輕Iso誘導(dǎo)大鼠VR超微結(jié)構(gòu)的損傷 電鏡下醋酸鈾染色可見(jiàn)：對(duì)照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，核仁清晰，肌膜及細(xì)胞器完整，閏盤(pán)、Z線清楚，無(wú)膠原纖維增生；模型組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，核仁不清楚，肌絲排列紊亂，閏盤(pán)及Z線顯示不清，線粒體腫脹，嵴消失、斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，部分心肌細(xì)胞核染色質(zhì)呈早期凋亡形態(tài)改變，膠原纖維大量增生呈片狀；氯沙坦組較模型組有明顯改善，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致正常，閏盤(pán)清楚，細(xì)胞變性程度較輕，間質(zhì)略水腫，肌漿網(wǎng)略有擴(kuò)張，未見(jiàn)明顯壞死，膠原纖維偶見(jiàn)點(diǎn)狀增生，膠原增生明顯受抑，見(jiàn)圖3。

2.4 氯沙坦可減輕Iso誘導(dǎo)的VR大鼠心室增大 與對(duì)照組比較，模型組LVDd，LVDs，LVPWd，LVPWs明顯增加(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，氯沙坦各劑量組上述指標(biāo)不同程度降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.5 氯沙坦可改善Iso誘導(dǎo)的VR大鼠心室功能 與對(duì)照組比較，模型組MFD及尾動(dòng)脈壓(CBP)明顯增加，EF和FS明顯下降；氯沙坦三個(gè)劑量組均能降低MFD和CBP，提高EF和FS水平(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表1。

圖1 HE染色檢測(cè)氯沙坦對(duì)Iso誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞的影響(×400)

圖2 Masson特殊染色檢測(cè)氯沙坦對(duì)Iso誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞的影響

圖3 電子電鏡檢測(cè)氯沙坦對(duì)Iso誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞的影響

組別劑量(mg/kg)形態(tài)學(xué)指標(biāo)(d/cm)LVDdLVDsLVPWdLVPWsMFD(μm)CBP(mmHg)收縮功能指標(biāo)(%)EFFS對(duì)照組-0.61±0.050.30±0.020.22±0.020.30±0.0110.7±0.9117±9.853.1±8.351.5±4.8模型組3.00.65±0.061)0.39±0.042)0.28±0.022)0.37±0.042)18.2±1.12)190±12.62)25.3±3.62)35.3±4.72)氯沙坦組5.00.62±0.053)0.36±0.033)0.27±0.023)0.36±0.033)15.6±1.23)160±14.73)32.3±4.73)37.6±3.63)10.00.62±0.033)0.34±0.034)0.25±0.013)0.35±0.023)14.5±1.33)142±12.33)35.6±3.24)40.5±3.93)20.00.61±0.054)0.33±0.024)0.23±0.024)0.31±0.034)12.1±0.84)127±11.54)38.7±3.54)46.7±4.74)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.6 氯沙坦可降低Iso誘導(dǎo)的大鼠HW/BW、LVI 與對(duì)照組比較，模型組HW/BW、LVI含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)，氯沙坦三個(gè)劑量組均能降低HW/BW，LVI水平(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.7 氯沙坦可降低Iso誘導(dǎo)VR中TGF-β1表達(dá) 對(duì)照組TGF-β1表達(dá)量(69.12±19.98)很少；模型組TGF-β1陽(yáng)性深棕色染色細(xì)胞數(shù)明顯增多(166.89±32.65)(P<0.01)，主要分布于胞質(zhì)中，說(shuō)明Iso能促進(jìn)TGF-β1表達(dá)；氯沙坦組三個(gè)劑量組不同程度地抑制了TGF-β1表達(dá)(高、中、低劑量組分別為68.76±23.69、79.90±18.21、101.86±34.38，P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)圖4。

2.8 氯沙坦可降低Iso誘導(dǎo)VR中p-PKCα表達(dá) 與對(duì)照組比較(設(shè)為1)，模型組p-PKCα表達(dá)(6.73)明顯升高(P<0.001)，氯沙坦高、中、低三個(gè)劑量組均能降低VR心肌組織中p-PKCα表達(dá)(分別為1.83、2.58、5.07，P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖5。

表2 氯沙坦對(duì)VR大鼠HW/BW、LVI的影響

圖4 氯沙坦對(duì)Iso誘導(dǎo)VR 中TGF-β1表達(dá)的影響

圖5 Western印跡檢測(cè)氯沙坦對(duì)Iso誘導(dǎo)VR 中p-PKCα表達(dá)的影響

3 討 論

VR是心臟對(duì)各種刺激所產(chǎn)生的反應(yīng)性增生，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞增大和心臟重量增加，左室重構(gòu)是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，最終導(dǎo)致心力衰竭甚至猝死。VR包括心肌細(xì)胞肥大和心肌間質(zhì)增殖及心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重建等。心肌纖維化可引起心室重構(gòu)，包括實(shí)質(zhì)重構(gòu)和間質(zhì)重構(gòu)；前者表現(xiàn)為心肌細(xì)胞出現(xiàn)病理性肥大、變性、壞死等改變；后者表現(xiàn)為心肌間質(zhì)纖維化及ECM膠原網(wǎng)的含量和組成等改變〔7〕。大劑量Iso可引起部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)變性與壞死、心肌(細(xì)胞)肥大、膠原纖維增生等光鏡及電鏡超微結(jié)構(gòu)改變，與缺血性心肌壞死類(lèi)似〔8〕，可以用于誘導(dǎo)心肌缺血壞死動(dòng)物模型。氯沙坦各劑量組治療后，其超微結(jié)構(gòu)明顯改善，提示氯沙坦可以逆轉(zhuǎn)VR引起的心肌超微結(jié)構(gòu)損害，與國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果相似〔9〕。

VR的重要組成部分是心肌間質(zhì)中基質(zhì)膠原的增加以及膠原類(lèi)型、組分和相互連接的改變，為導(dǎo)致心室舒張功能障礙的主要原因〔10〕，HW/BW目前已被用來(lái)作為觀察VR的重要指標(biāo)〔11〕。使用Iso后大鼠心肌出現(xiàn)明顯的間質(zhì)纖維化。Masson染色顯示應(yīng)用Iso造模后，心肌間質(zhì)和血管周?chē)写罅磕z原纖維沉積，證實(shí)Iso能造成膠原沉積和心肌肥厚引起VR，氯沙坦能減輕心肌肥厚，抑制心肌間質(zhì)細(xì)胞膠原含量的增加而改善VR，與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔12〕。

在VR分子機(jī)制的研究中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已成為近年來(lái)關(guān)注的焦點(diǎn)和研究熱點(diǎn)，PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活在心肌肥厚引起的VR中起重要作用〔13〕；PKCα可以介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥厚，包括蛋白質(zhì)合成增加、蛋白/DNA比率升高、細(xì)胞表面積增大等。TGF-β1是VR發(fā)生中的關(guān)鍵因子，通過(guò)上調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原合成〔14〕，調(diào)節(jié)組織修復(fù)〔15〕，調(diào)節(jié)ECM蛋白〔16〕并抑制膠原酶的釋放等促進(jìn)VR生成。本研究發(fā)現(xiàn)，Iso可引起p-PKCα活性升高進(jìn)而促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)，導(dǎo)致心肌肥厚、心肌膠原纖維沉積、ECM增多發(fā)生VR〔17〕；氯沙坦可抑制p-PKCα信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少TGF-β1生成，減輕VR。

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〔2016-05-17修回〕

(編輯 郭 菁)

吉林市科委資助課題(201437026)

于杜娟(1980-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事信號(hào)通路的相關(guān)研究。

于 敏(1968-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事心肌病的臨床研究。

R542.2

A

1005-9202(2016)20-4982-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.018

1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院