艾灸對阿爾茨海默病模型大鼠海馬形態學的影響

王述菊 馬 駿 孫國杰 沈 峰 李 熙 萬博鵬

(湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065)

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艾灸對阿爾茨海默病模型大鼠海馬形態學的影響

王述菊 馬 駿 孫國杰 沈 峰 李 熙 萬博鵬

(湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065)

目的 探討艾灸治療對阿爾茨海默(AD)模型大鼠海馬組織形態學的影響。方法 健康雄性15個月齡SD大鼠40只，隨機分為正常組、假手術組、模型組、艾灸組，每組10只。采用雙側海馬一次性注射聚集態β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35制備AD大鼠模型，造模完成后第 2天開始進行艾灸治療，在大鼠“腎俞”、“足三里”、“百會”上方2～3 cm處溫和灸。每日治療1次，每穴艾灸5 min，6 d為1療程，休息1 d后繼續下1個療程，共治療3個療程。HE 染色及透射電鏡觀察大鼠海馬CA1區神經細胞結構的形態學變化。結果 HE 染色觀察結果顯示，模型組大鼠海馬CA1區神經細胞數量較正常組和假手術組明顯減少，神經細胞受損缺失，細胞核固縮。運用艾灸治療后，大鼠海馬CA1區神經細胞核固縮現象明顯改善，形態較規則，排列較整齊。透射電鏡觀察結果顯示，Aβ在大鼠腦內能引起海馬CA1區神經細胞的退行性改變，神經元體積縮小，形態不規則，線粒體腫脹，基質清淡、有空泡，數目減少，還可見到線粒體嵴呈畸形樣改變，內質網擴張，脂褐素沉積增多。運用艾灸治療后，大鼠海馬CA1區神經細胞水腫明顯減輕，內質網擴張明顯改善，線粒體腫脹明顯減輕。結論 艾灸治療可促進神經細胞的修復，艾灸對AD模型大鼠海馬神經細胞的退行性改變有明顯改善作用。

阿爾茨海默?。籄β25～35；艾灸；海馬；形態學

阿爾茨海默病(AD)臨床上主要表現為記憶能力、判斷能力、學習能力、思維能力、認知能力以及行動能力、生活自理能力普遍下降，給患者生活質量和家庭生活都帶來了困擾。AD 的主要病理特征是神經元的選擇性丟失及因超磷酸化Tau蛋白和β淀粉樣蛋白(Aβ)在神經元內外的異常積聚而分別形成的神經元纖維纏結(NFT)和老年斑(SP)，Aβ沉積是AD發病的主要致病因素〔1，2〕。本實驗采用雙側海馬一次性注射聚集態Aβ25～35制備AD大鼠模型，運用艾條溫和灸“腎俞”、“足三里”、“百會”進行治療，HE 染色及透射電鏡觀察艾灸治療對大鼠海馬CA1區神經細胞的形態學變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性15個月齡SD大鼠40只，體重350～450 g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供〔合格證:SCXK(鄂)2010-0009〕。先進行Y型水迷宮篩選〔3〕，淘汰反應過于遲鈍或特別敏感的大鼠，將合格大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、艾灸組，每組10只。

1.2 主要儀器及試劑 ES-2100S電子天平(長沙湘平科技發展有限公司)，Y型水迷宮(中國醫學科學院藥物所)，DW-5腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)，臺式牙鉆機(成都康發醫療器械有限公司)，Sartorius分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，5 μl微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠)，TB-718E 型生物組織自動包埋機(湖北泰維醫療科技有限公司)，輪轉式石蠟切片機(德國Leitz公司)，日產 Olympus 光學顯微鏡，LEICA ULTRACUTUCT超薄切片機(德國)，FEI Tecnai G212透射電鏡(荷蘭)，Aβ25～35(美國sigma公司)，1%鋨酸、2.5%戊二醛(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 造模方法 先進行Aβ25～35孵育，將Aβ25～35用無菌生理鹽水稀釋成5 μg/μl，密封后放在 37℃培養箱中孵育1 w，老化成具有毒性的聚集狀態，然后放在4℃冰箱中保存備用。

AD大鼠模型制備采用腦立體定位儀下給予雙側海馬一次性注射聚集態Aβ25～35〔4〕。大鼠用10%水合氯醛(40 mg/100 g體重)腹腔注射進行麻醉，前后囟保持在同一水平將鼠頭固定在腦立體定位儀上，消毒后剪開頭皮，定位海馬區〔5，6〕(前囟后3.5 mm，中線旁開2.0 mm，硬腦膜下2.7 mm)，左右兩側海馬區定位完成后，用臺式牙鉆機在此鉆一直徑1 mm的小孔，微量進樣器垂直插入，每側緩慢注射Aβ25～35聚集液1 μl，為了使Aβ25～35聚集液充分浸潤局部組織，注射完畢后留針5 min再緩慢拔針。完成后馬上縫合頭皮，術后每天肌肉注射青霉素10萬U/只，連續注射5 d。

1.4 各組處理方法 ①艾灸組：造模完成后第2天開始進行艾條溫和灸治療。穴位選取參照華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》〔7〕，采用自制的直徑約8 mm艾條，在大鼠“腎俞”、“足三里”、“百會”穴上方2～3 cm處溫和灸?！澳I俞”位于第2腰椎下兩旁，“足三里”位于膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處，“百會”位于頂骨正中?！澳I俞”、“足三里”穴左右隔日交替使用。每日艾條溫和灸治療1次，每穴艾灸5 min，6 d為1個療程，休息1 d后繼續下1個療程，共治療3個療程。②模型組：按照前述造模方法制備AD大鼠模型，造模完成后大鼠每日與艾灸組大鼠相同時間相同方法進行抓取、固定，但不進行艾條溫和灸治療。③假手術組：腦立體定位儀下雙側海馬區注射等量生理鹽水，其他操作同模型組。④正常組：同步喂養，不做任何處理。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 HE 染色觀察 行為學檢測完成后第 2 天，隨機在每組取4只大鼠進行HE染色觀察。大鼠用10%水合氯醛按照40 mg/100 g體重進行腹腔注射麻醉，先用0.9%生理鹽水迅速灌注，再用4%多聚甲醛灌注固定。斷頭快速取腦組織，在視交叉平面前后4 mm處將腦組織冠狀面切開，留取中間部分放置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定過夜。將固定后的腦組織常規上行脫水、二甲苯透明后進行石蠟包埋，蠟塊連續冠狀切片，進行 HE 染色。

1.5.2 透射電鏡觀察 行為學檢測完成后第 2 天，隨機在每組取4只大鼠用10%水合氯醛按照40 mg/100 g體重進行腹腔注射麻醉，先用0.9%生理鹽水快速灌注，再用2.5%戊二醛磷酸緩沖液灌注固定，斷頭快速取腦組織，然后分離出海馬組織。2.5%戊二醛固定，磷酸緩沖液清洗，1%鋨酸后固定，丙酮脫水，環氧丙烷浸透，環氧樹脂包埋，聚合后超薄切片機切片，透射電鏡觀察并攝片記錄。

2 結 果

正常組和假手術組大鼠海馬CA1區神經細胞形態完整，排列整齊。模型組大鼠海馬CA1區神經細胞數量較正常組和假手術組明顯減少，神經細胞受損缺失，細胞核固縮，核仁欠清晰。艾灸組大鼠海馬CA1區神經細胞核固縮現象明顯改善，形態較規則，排列較整齊，見圖1。

透射電鏡觀察結果顯示：正常組和假手術組大鼠海馬CA1區神經細胞形態完整，結構清楚，排列整齊。模型組大鼠海馬CA1區神經元體積縮小，形態不規則，線粒體腫脹，基質清淡、有空泡，數目減少，還可見到線粒體嵴呈畸形樣改變，內質網擴張，脂褐素沉積增多。艾灸組大鼠海馬CA1區神經細胞水腫明顯減輕，內質網擴張及線粒體腫脹明顯改善，高爾基體、線粒體、核糖體數目較模型組明顯增多，見圖2。

圖1 各組大鼠海馬CA1區HE 染色觀察圖(HE，×200)

圖2 各組大鼠海馬CA1區透射電鏡觀察圖(標尺=0.5 μm)

3 討 論

中醫學認為，AD的病位在腦，其病理性質為本虛標實〔8～10〕。本虛主要在于腎精虧虛，髓海不足，腎精虧虛是老年性癡呆的發病根本，老年性癡呆的發生與髓海不足有密切關系，而《素問·逆調論》中的“腎不生，則髓不能滿”說明了髓海不足的根源在于腎虛不生。其標實在于痰濁、瘀血蒙蔽腦竅，痹阻腦絡，且與五臟都有著重要關系。人體臟腑功能失調，氣血津液運行失常，體內的痰濁、瘀血日久化為濁毒，濁毒損傷脈絡可致腦竅失養、神機不明而發為癡呆〔11〕。何珊等〔12〕運用臟腑辨證中的五臟理論概括AD的中醫病機，認為腎虛髓減是癡呆發病的重要因素，肝腎陰虛，脾腎不足，心脾氣血兩虛均可致痰濁、濕氣、瘀血、郁火阻滯腦絡，閉塞腦竅而發癡呆，亦可從肺論治，若肺氣宣發肅降、通調水道不利，則難免產生痰濁、瘀血而發病。西醫學認為，AD典型的病理改變是Aβ淀粉沉積物和SP的形成以及細胞內NFT和神經元細胞數目減少、神經膠質細胞的炎性改變〔13〕。Aβ的聚集引起了神經細胞的功能紊亂和死亡，最終導致癡呆〔14〕。Aβ纖維沉積的危害，主要表現在以下幾個方面〔15〕：①Aβ能夠通過線粒體途徑，導致線粒體內過氧化環境的產生，加重了細胞器的損傷，從而引起細胞凋亡；②Aβ可能參與了炎癥反應，起到了炎性介質的作用，Aβ的累積促成了AD患者病灶處炎性反應的強度，同時激發NFT的形成。

海馬是中樞神經系統中參與學習和記憶貯存的重要器官，與學習記憶認知活動密切相關〔16，17〕。研究發現AD 患者的海馬體積出現明顯的萎縮，海馬的體積和徑線長度都相比正常人有所減小〔18〕。實驗研究〔19，20〕將Aβ25～35聚集液一次性注入大鼠雙側海馬造模后，AD 大鼠出現了學習記憶功能障礙，證實了作為學習記憶重要結構的海馬組織遭到破壞。針灸因其適應證廣泛、操作運用簡單、安全無毒副作用等優點，引起醫學界的高度關注，針灸在臨床上治療AD療效亦得到充分肯定。艾灸法以其藥物作用和溫熱刺激，可溫經通絡、活血化瘀，軟堅散結、溫腎健脾，益氣補陽、回陽固脫，扶正祛邪，對慢性病及經絡痹阻、陽氣虛寒者尤為適宜。本實驗選用“腎俞”、“足三里”、“百會”艾條溫和灸治療。腎精虧虛為AD發病之本，腎俞是腎臟精氣輸注于背部的重要腧穴，為腎之背俞穴，艾灸腎俞有調理臟腑，補益腎精之功。痰濁瘀血痹阻是AD發病之標，而痰濁、瘀血的產生與脾胃運化失常有關。脾胃乃后天之本，氣血生化之源，有腐熟水谷，運化水濕之功。足三里是胃腑下合穴，艾灸足三里可健脾和胃，補益氣血，脾胃健運則可蠲化痰濁，疏散瘀血。百會位于巔頂，是督脈重要腧穴，而督脈與腦、腎有密切關系，艾灸百會是近治作用選穴，具有益腎補腦，調督醒神之功。

本實驗結果表明艾灸治療可促進神經細胞的修復，艾灸對AD模型大鼠海馬神經細胞的退行性改變有明顯改善作用。

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〔2015-05-22修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

湖北省教育廳科學技術研究項目(Q20101803)；武漢市科技局青年科技晨光計劃項目(201150431126)

馬 駿(1964-)，女，教授，醫學博士，主要從事針灸防治腦病及神經系統疾病的研究。

王述菊(1977-)，女，副教授，醫學博士,主要從事針灸防治腦病及神經系統疾病的研究。

R245

A

1005-9202(2016)20-4993-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.022