苦蕎莖葉提取物對黑美人馬鈴薯多酚氧化酶的抑制效果

劉輝+盧揚+李俊+呂都+陳朝軍+雷尊國+劉永翔

摘要：多酚氧化酶是植物體內酶促褐變的關鍵酶。為篩選安全無毒、處理簡單的多酚氧化酶抑制劑，以苦蕎莖葉乙醇提取物、水提取物、磷酸鹽緩沖液提取物為褐變抑制劑，研究其對黑美人馬鈴薯多酚氧化酶的抑制效果。結果表明，3種提取物均對馬鈴薯多酚氧化酶具有顯著的抑制效果，當抑制劑體積為120 μL時，酶活抑制率分別為70.14%、73.38%、84.53%，表明磷酸鹽緩沖液提取物的抑制效果最佳。對3種提取物中總黃酮、蛋白質含量進行定量，結果表明磷酸鹽緩沖液提取物中不僅具有較高含量的黃酮類物質，同時蛋白質含量也較高，推測磷酸鹽緩沖液提取物抑制效果最好的原因就在于此。研究結果可為探尋馬鈴薯多酚氧化酶的天然抑制劑和馬鈴薯深加工過程中褐變控制提供新的思路和參考依據。

關鍵詞：苦蕎；莖葉；多酚氧化酶；馬鈴薯；抑制劑

中圖分類號： TS205 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0307-03

“黑美人”馬鈴薯是一種表皮與果肉均呈黑紫色的馬鈴薯品種，它的蛋白質、還原糖、有機酸含量高于普通馬鈴薯，而脂肪含量較低，從而具有高營養、低能量的特點，是一種健康、營養的食品原料。同時，“黑美人”馬鈴薯富含普通馬鈴薯所缺乏的花青素、維生素C、胡蘿卜素等抗氧化物質，使其兼具抗癌、抗衰老、美容和防止高血壓等多種保健作用[1]。馬鈴薯中富含的多酚類物質是多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）引起酶促褐變的底物，而酶促褐變中產生的黑色素對馬鈴薯的色澤、品質造成很大的影響，從而降低其深加工產品的質量和市場競爭力。因此，開發出合適的褐變抑制劑，對馬鈴薯加工過程中的褐變過程加以控制，對提高黑美人馬鈴薯的應用價值和其加工產品的質量、競爭力具有重要的意義[2]。

植物提取物作為天然的抑制劑，具有天然無毒特性，更易被消費者所接受，故近年來成為研究的熱點[3-4]。苦蕎源于我國西南地區，在全國廣泛種植，但是分布較集中，貴州地區苦蕎常年種植面積達4.6萬hm2。蕎麥種子已經被開發成各種產品，如苦蕎米飯、苦蕎茶、苦蕎酥餅等，而蕎秸（葉、稈）多作為柴火燒掉，如能加以開發利用，其經濟效益將會非常可觀[5]。苦蕎莖葉中的主要有效活性成分是黃酮類物質（蕓香苷、槲皮素、山奈酚等），其醇提物表現出較強的抗氧化性，具有抗癌變、降脂、降壓、美容等功效[6-7]。近年來，對于苦蕎的研究主要集中在成分及藥用分析，很少涉及酶學領域，苦蕎莖葉提取物對植物PPO抑制作用的報道甚少，特別是酶的抑制作用動力學的研究幾乎還是空白。在篩選植物體的多酚氧化酶抑制劑的試驗中，研究發現苦蕎莖葉提取物可以對多酚氧化酶產生抑制作用。本研究采用50%乙醇提取法、水提取法及磷酸鹽緩沖液提取法分別提取苦蕎莖葉中的PPO抑制劑，比較這3種提取物對馬鈴薯PPO的抑制效應，為苦蕎莖葉提取物在食品保鮮、褐變控制方面的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑美人馬鈴薯和苦蕎莖葉均由貴州省農業科學院生物技術研究所提供；蕓香苷購自上海永葉生物科技有限公司，其他試劑均為國產分析純。所需儀器包括Allegra 25R高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）、SJIA-10N低溫真空冷凍干燥器（寧波市雙嘉儀器有限公司）、XL-30C超微粉碎機（杭州旭眾機械設備有限公司）、UV-2100雙光束紫外可見分光光度計[北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司]、RE-52AA 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）等。

1.2 方法

1.2.1 黑美人馬鈴薯PPO的提取與純化 黑美人馬鈴薯多酚氧化酶的提取與純化參考彭益強等的方法[8]。

1.2.2 苦蕎莖葉的提取方式 參考曹艷萍等的方法[9]：苦蕎莖葉在低溫真空冷凍干燥器中干燥3～4 h后，用超微粉碎機加工成粉末。取粉末20 g，加200 mL蒸餾水和200 mL乙醇[水提取物和磷酸鹽提取物僅加400 mL蒸餾水或磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH=6.8）]于大錐形瓶中，攪拌均勻，置于超聲波清洗器中，50 ℃下超聲波萃取1.5 h，用布氏漏斗抽濾得濾液，用旋轉蒸發器蒸發除去乙醇及大部分水分得濃縮液，用冷凍干燥器干燥成粉末。取凍干粉配成15 mg/mL溶液，15 000 r/m離心10 min，除去沉淀備用。

1.2.3 苦蕎莖葉提取物中總黃酮、蛋白質定量分析 黃酮類物質含量測定：參考曹艷萍的方法[10]進行。

蛋白質定量：參照張午燕的方法[11]進行。

1.2.4 PPO動力學研究方法 參照林敏等的方法[12]進行，將其中的底物L-DOPA換成鄰苯二酚，具體操作如下：將pH值6.8的磷酸緩沖液、0.2 mol/L的鄰苯二酚及PPO液在30 ℃的水浴中預保溫，在比色皿中依次加入2.0 mL的磷酸緩沖液、0.3 mL的酶液、0.5 ml濃度為0.2 mol/L的鄰苯二酚溶液（空白對照為2.5 mL的磷酸緩沖液、0.3 mL的酶液），在反應組和空白對照組中分別加入0、15、30、60、120、240 μL的3種苦蕎莖葉提取物，用UV-2100雙光束紫外可見分光光度計在413 nm處比色，每4 s計數1次，記錄各時刻的吸光度D413 nm，將在相同時刻測得的2個D413 nm，相減并作圖，得苦蕎莖葉提取物對黑美人馬鈴薯PPO活性影響的動力學特征曲線。

1.3 數據統計分析

每個樣品設3個生物學重復，用SPSS 18.0統計軟件對試驗數據進行分析，測定結果以平均值±標準差表示，以P<0.05 表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 苦蕎莖葉提取物對馬鈴薯多酚氧化酶酶促反應動力學曲線的影響

從圖1-A中可以看出，水提取物在15 μL時，對PPO活性抑制效果不明顯；在添加量為30 μL時，抑制效果才顯現，并在40 s時，PPO活性受到完全抑制；在添加量為60 μL時，在32 s時PPO活性受到完全抑制；當苦蕎莖葉水提取物含量達到120 μL時，16 s時即使馬鈴薯PPO活性受到抑制；在添加量為240 μL時，基本使馬鈴薯PPO完全失活。

從圖1-B中可以看出，苦蕎莖葉醇提取物在15 μL時對馬鈴薯的抑制效果已經開始顯現，但是在1 min的測定時間內，沒有使PPO活性完全受到抑制；在添加量為30、60、120 μL 時使PPO完全失活的時間分別為40、28、16 s；在240 μL 時，馬鈴薯PPO活性完全受到抑制。

從圖1-C中可以看出，苦蕎莖葉磷酸鹽提取物在15 μL時對馬鈴薯的抑制效果顯著，在48 s時可使馬鈴薯PPO完全失活；在添加量為30、60、120 μL時使PPO完全失活的時間分別為32、24、12 s；在240 μL時，馬鈴薯PPO活性完全受到抑制。

3種苦蕎莖葉提取物對PPO活性影響的動力學曲線（圖1）表明：馬鈴薯PPO氧化鄰苯二酚的反應和產物的生成速度初始較快，隨著反應時間的延長，PPO的活性逐漸降低，曲線斜率逐漸降低，這是由于生成的醌類物質使多酚氧化酶活性受到抑制的結果，即存在反饋抑制作用。說明3種提取物對馬鈴薯PPO的抑制作用都是可逆的。

2.2 3種提取物對馬鈴薯PPO活性影響的比較

表1結果表明，3種提取物對黑美人馬鈴薯PPO存在顯著的抑制效果，且提取物間差異顯著，其中以磷酸鹽提取物的抑制效果最佳。

2.3 3種提取物成分分析

由表2可以看出，磷酸鹽提取物中的蛋白質濃度與總黃酮濃度均較高，水提取物中的總黃酮含量最低。

3 討論

苦蕎莖葉中的主要有效活性成分是黃酮類，已從苦蕎莖葉中分離鑒定出蕓香苷、槲皮素、山奈酚等多種黃酮類成分[9，11]。劉文山等發現黃酮物質可抑制蘋果多酚氧化酶活性[13]。林敏等用柿葉提取物對馬鈴薯PPO的抑制效果進行了研究，發現它可以非競爭性地抑制PPO活性[12]。柿葉提取物中的主要有效活性成分是黃酮，它是一種抗氧化劑，可清除氧自由基，從而阻斷氧對PPO的激活。同時，黃酮結構中的還原性羥基具有孤對電子，可與PPO分子中的Cu2+絡合，從而影響PPO的活性。

本試驗研究結果表明：苦蕎莖葉水提物、50%乙醇提取物、0.2 mol/L pH值6.8的磷酸鹽緩沖液提取物對黑美人馬鈴薯PPO活性均存在抑制作用，表明苦蕎莖葉含有多種PPO抑制成分；磷酸鹽提取物的抑制效果強于醇提取物與水提取物；3種提取物對PPO的抑制作用均為可逆的。Kubglomsong等發現從米糠中提取的蛋白質，在pH值為4～5的環境中，對馬鈴薯塊莖PPO具有較強的抑制效應[14]。同時，對米糠提取物中的有效成分進行高效液相色譜分離并定量分析，發現原兒茶酸、香草酸、香豆酸等對馬鈴薯PPO抑制效果不一致，混合物的抑制效果最佳[2]。另外發現，各種氨基酸對PPO也具有抑制效應[15]。本試驗對3種提取物中的蛋白質和總黃酮含量進行了測定，結果表明磷酸鹽提取物中的蛋白質含量最高，而總黃酮含量也達到58.4 mg/g，而醇提取物中的總黃酮含量最高，達到71.4 mg/g（表2）。因此，磷酸鹽提取物對馬鈴薯PPO的抑制效果最佳，很可能是因為其同時含有較高含量的蛋白質和總黃酮。乙醇提取物中的蛋白質含量遠遠低于水提取物，而醇提取物對馬鈴薯PPO的抑制效果卻強于水提取物，表明苦蕎莖葉中對PPO產生抑制作用的主要有效成分是黃酮類物質。動物藥理試驗表明，苦蕎葉提取物可提高紅細胞超氧化物歧化酶活性，對羥自由基和超氧陰離子均有較強的清除能力[10，16]。黃酮類化合物含有能提供活潑質子的多酚結構，并以C6—C3—C6結構為基本母核[17]，因此，推測黃酮類物質是通過原子的空間排列位阻或改變PPO酶蛋白的空間結構，從而阻止底物與酶的結合，其中黃酮化合物中羥基的數目和空間排列是其抑制作用的決定因素，一般羥基數目越多，抑制效果越好，羥基鄰位排列比間位排列的抑制作用更佳[18]。

經過對苦蕎莖葉提取物抑制馬鈴薯PPO作用的動力學研究，推測其抑制機理與其抗氧化特性機理及蛋白質、氨基酸與多酚、PPO的相互作用有關。參考Sukhonthara等的研究結果[2，12，15]，筆者認為其可能的機制為：（1）苦蕎莖葉提取物對氧自由基的清除作用既阻斷了氧與PPO反應的引發，同時，削弱了PPO的供氧作用，阻斷了氧對PPO的激活，從而抑制了褐變的強度；（2）黃酮類化合物中的還原性羥基中的孤對電子，可與PPO分子中的Cu2+發生絡合反應，從而達到影響PPO酶活性的效果；（3）提取物中的蛋白質、氨基酸可與褐變反應的底物多酚發生反應，形成有色物質并與褐色相區別，從而阻斷了褐變反應的發生，或者催化PPO氧化產物醌降解，從而減少褐變物質的產生。

4 結論

苦蕎莖葉水提取物、醇提取物、磷酸鹽提取物對黑美人馬鈴薯PPO均具有顯著抑制效果，且均表現為可逆性抑制。在添加量為120 μL時，抑制率分別達到70.14%、73.38%、84.53%，表明磷酸鹽緩沖液提取物對黑美人馬鈴薯PPO的抑制效果最佳。

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