川芎嗪對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力和細胞周期蛋白E、P21表達的影響

尹淑杰 張 濤 榮光影 宋慶嬌 汪 悅 柳朝陽

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

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川芎嗪對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力和細胞周期蛋白E、P21表達的影響

尹淑杰1張 濤 榮光影 宋慶嬌 汪 悅 柳朝陽2

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討川芎嗪(TMP)對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠學習記憶和細胞周期蛋白(Cyclin)E、P21表達的影響及作用機制。方法 大鼠海馬區注入β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42制作AD模型。Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力；免疫組化法檢測海馬區CyclinE和P21蛋白的表達。結果 低、高劑量TMP組均能改善 AD大鼠的學習記憶能力(P<0.01，P<0.05),下調大鼠海馬CyclinE蛋白表達(P<0.05),上調P21蛋白表達(P<0.05)。低、高劑量TMP組相比無明顯差異。結論 TMP能改善AD大鼠學習記憶功能,下調CyclinE蛋白和上調P21蛋白表達，減輕神經細胞凋亡。

川芎嗪；阿爾茨海默病；細胞凋亡

阿爾茨海默病(AD)的病理特征為神經元纖維纏結、老年斑和神經元廣泛丟失等〔1〕。有研究表明〔2〕細胞凋亡是引起大量神經元丟失的主要原因之一，細胞凋亡可通過細胞周期蛋白的異常表達介導〔3〕。故通過調節細胞周期相關蛋白的表達可以減少神經細胞凋亡，延緩AD發病。本實驗采用β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～42海馬區注入制作 AD 模型，觀察川芎嗪(TMP)對AD大鼠學習記憶能力及海馬區細胞周期蛋白E(CyclinE)和P21蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 采用10～14月齡SD大鼠，體重 210～230 g，佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑 磷酸川芎嗪片(北京市燕京制藥廠,50 mg/片,批號030201)；Aβ1～42(Sigma公司)；兔抗大鼠CyclinE多克隆抗體，兔抗大鼠P21多克隆抗體，免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 AD模型建立〔4〕和動物分組 大鼠麻醉后，固定在顱腦立體定位儀，暴露前囟，按大鼠腦立體定位圖譜進行定位，在前囟后方 3.3 mm、中線左右各旁開1.9 mm穿顱鉆一小孔(直徑約1 mm)，將微量注射器垂直插入，緩慢進針2.4 mm 至海馬，分別注入Aβ1～425 μl，注射后留針 5 min，緩慢拔針。術后牙托粉封固顱骨孔,青霉素預防感染。

將40只SD大鼠隨機分為五組(每組8只)：正常對照組、假手術組、AD模型組、TMP低劑量組(150 mg·kg-1·d-1)(L-TMP組)、TMP高劑量組(250 mg·kg-1·d-1)(H-TMP組)。

1.3.2 Morris水迷宮實驗〔5〕造模后第7天起進行水迷宮實驗，連續5 d，前4 d作逃避潛伏期實驗。在水迷宮中央隱蔽平臺的位置，將大鼠頭朝外壁在任何一個象限內的隨機位置放入水中，潛伏期是指大鼠在120 s內從入水點爬到平臺所需時間。實驗中，如果在120 s內大鼠找到平臺，讓大鼠站立在平臺上10 s；如果找不到，引導大鼠爬上平臺，并站立10 s，潛伏期計為120 s。空間探索實驗在第5天進行，平臺撤掉，從第二象限任何點放大鼠入水，記錄大鼠在120 s內的游泳路徑,計算大鼠在入水象限游泳路徑長度占總路徑長度的百分比。Morris水迷宮圖像處理系統完成數據采集和處理。

1.3.3 免疫組化法檢測大鼠海馬CyclinE和P21蛋白的表達 取大鼠海馬組織于4%多聚甲醛中固定24 h,進行乙醇系列脫水、二甲苯透明、常規石蠟包埋,制成4 μm厚連續切片。切片常規脫蠟至水,高壓修復抗原,冷卻后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,滴加適當稀釋的一抗,37℃恒溫水浴箱孵育2 h,滴加二抗,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木素復染,脫水,透明,封片。經DAB顯色,CyclinE和P21陽性細胞為黃褐色。 用PBS代替一抗作為陰性對照。 在CyclinE和P21免疫組化染色切片的海馬區各取3個視野(×400),應用圖像分析系統測量每個視野內CyclinE和P21陽性細胞數。

1.4 統計學方法 應用SPSS11.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 Morris 水迷宮實驗結果 與正常對照組相比，在前4 d逃避潛伏期實驗中，AD模型組潛伏期明顯延長(P<0.01)；與正常對照組相比，在第5天空間探索實驗中，AD模型組穿越平臺象限路徑占總路徑百分比降低(P<0.05)。與AD模型組相比，低、高劑量TMP組逃避潛伏期和穿越平臺象限路徑百分比明顯改善(P<0.01，P<0.05)。高劑量TMP組較低劑量TMP組有所改善，但無統計學意義。正常對照組和假手術組逃避潛伏期和穿越平臺象限路徑比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠水迷宮實驗結果

與正常對照組相比：1)P<0.01，2)P<0.05；與AD模型組相比:3)P<0.01，4)P<0.05

2.2 免疫組化檢測CyclinE和P21蛋白表達結果 與正常對照組相比，假手術組CyclinE和P21表達陽性細胞數無顯著差異(P>0.05)，而AD模型組大鼠海馬組織CyclinE陽性細胞數明顯增加(P<0.05)，P21陽性細胞數明顯減少(P<0.01)；與AD模型組相比,TMP各組CyclinE陽性細胞數明顯減少(P<0.05)，P21陽性細胞數明顯增加(P<0.05)；低、高劑量TMP組相比，CyclinE和P21陽性細胞數均無顯著性差異(P>0.05)。提示TMP能減少CyclinE的表達和增加P21的表達。見表 2。

表2 各組大鼠海馬CyclinE和P21表達陽性細胞數

與正常對照組相比：1)P<0.01，2)P<0.05；與AD模型組相比:3)P<0.05

3 討 論

本實驗中AD大鼠學習能力和記憶保持能力明顯降低，TMP治療后AD大鼠的學習能力和記憶保持能力得以明顯改善。細胞凋亡是引起AD病理特征之一的神經元喪失的主要機制〔6〕。Cyclin、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)相互作用調控細胞周期，使細胞分裂正常進行。如果Cyclin、CDK或CKI三者的平衡被打破，細胞周期將重啟進入有絲分裂，后期出現障礙，細胞分裂失敗，細胞周期停滯，形成細胞凋亡〔7〕。

AD病人正常的腦神經細胞已停止分化處于G0期。Vincent等〔8〕發現，AD患者腦中有神經元重新進入細胞周期，由于CKI失活，導致神經細胞經過G1/S期檢驗點，DNA復制后進入G2期，但是細胞不能進行正常的分裂，凋亡程序啟動，細胞凋亡引發〔3〕。

CyclinE與CDK2結合在 G1/S 期啟動和運行中發揮作用。CyclinE可激活視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)，使其與轉錄因子(E2F)解離，E2Fs可促進形成CyclinE-CDK2復合體，使細胞越過G1/S期檢驗點，進入S期，CyclinE-CDK2復合體進一步磷酸化pRb，使E2F充分釋放，促進有關S期DNA復制的基因表達〔9〕。

P21屬于CKI家族成員，可結合并抑制CyclinE-CDK2等復合物的磷酸化活性，使Rb低磷酸化不能解離E2F而致DNA合成障礙，使細胞停滯在G1期。另外，P21分子可與增殖細胞核抗原(PCNA)結合，使PCNA不能與DNA聚合酶形成δ復合物，影響DNA的復制〔10〕，從而阻止細胞重新進入分裂周期失敗而導致細胞凋亡。

CyclinE在G1期表達，CyclinE-CDK2復合體正性調控細胞周期，而P21負性調控細胞周期，CyclinE與P21表達紊亂可引發細胞周期紊亂。

本文結果顯示，大鼠海馬區注入Aβ1～42后，可上調CyclinE表達，啟動了神經元的細胞周期；同時由于其神經毒性，使P21的表達抑制，打破細胞周期的平衡狀態，引發細胞凋亡。TMP可通過下調CyclinE蛋白表達和上調P21蛋白表達阻止細胞重新進入細胞周期，減少神經細胞凋亡，從而延緩AD大鼠腦神經病理進程，減少Aβ對腦細胞神經元的損傷，進而改善大鼠學習記憶能力。

1 Petrella JR,Coleman RE,Doraiswamy PM.Neuroimaging and early diagnosis of Alzheimer's disease:a look to the future〔J〕.Radiology，2003;226(2):315-36.

2 黃文林，朱孝峰.信號轉導〔M〕.北京:人民衛生出版社，2007:345-7.

3 McPhie DL，Coopersmith R，Hines-Peralta A，etaI.DNA synthesis and neuronal apoptosis caused by familial Alzheimer's disease mutants of the amyloid precursor protein are mediated by the p21 activated kinase PAK3 〔J〕.J Neurosci，2003;23(17)：6914-27.

4 朱飛奇，馬 英，錢采韻.大鼠海馬立體定向注射Aβ 1-40建立阿爾茨海默病動物模型〔J〕.鄖陽醫學院學報,2008;27(2):106-8.

5 劉潔生，陳 式，謝麗玲，彭志英.K-銀環蛇毒素對小鼠被動學習和空間記憶的影響〔J〕.衛生研究,1998;27(S1):96-9.

6 莊 瑩，陳 杰.阿爾茨海默病病因及發病機制研究進展〔J〕.吉林醫藥學院學報，2008;29(2)：101-4.

7 謝朝陽，祝其鋒.細胞周期調控與阿爾茨海默病的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2004;24(4)：379-81.

8 Vincent I,Rosado M,Davies P.Mitotic mechanisms in Alzheimer's disease〔J〕?J Cell Biol,1996;132(3):413-25.

9 Obaya AJ,Sedivy JM.Regulation of cyclin-Cdk activity in mammalian cells〔J〕.Cell Mol Life Sci,2002;59(1):126-42.

10 馬 驥，劉文超.細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑與腫瘤相關性的研究進展〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志，2009;16(3)：315-8.

〔2015-11-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

黑龍江省自然科學基金資助項目(H2015074)；黑龍江省大學生創新創業訓練項目(20050222026)；黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃項目(1252G059)；佳木斯大學科技重點項目(Sz2011-009)

柳朝陽(1971-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事神經干細胞和阿爾茨海默病機制研究。

尹淑杰(1969-)，女，副主任醫師，主要從事腦血管病、癲癇，頭痛及眩暈的診斷和治療研究。

R749.16

A

1005-9202(2016)20-4961-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.009

1 濟寧市第二人民醫院神經內科

2 佳木斯大學附屬第一醫院