替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對乳鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響

馬香芹 劉 芳 盧澤愷 趙汴霞 趙 娜 馬 莉 楊紅梅

(河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 鄭州 451191)

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替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對乳鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響

馬香芹 劉 芳 盧澤愷 趙汴霞 趙 娜 馬 莉 楊紅梅

(河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 鄭州 451191)

目的 探討替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響。方法 對Wistar乳鼠心肌成纖維細(xì)胞行體外原代及傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為5組：對照組(加入15%小牛血清DEME培養(yǎng)液)、AngⅡ組(15%小牛血清DEME培養(yǎng)液+1×10-6mol/L AngⅡ)，替米沙坦組(TE組，在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦)，氨氯地平組(AM組，AngⅡ組基礎(chǔ)上加入1 μmol/L氨氯地平)及替米沙坦+氨氯地平組(TE+AM組)，在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦+1 μmol/L氨氯地平)，每組3份。觀察各組細(xì)胞不同時期增殖情況及TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與對照組相比，AngⅡ組心肌成纖維細(xì)胞在S期時增殖率較高，而在G0/G1期、G2/M期時增殖率下降(P<0.05)，TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與AngⅡ組相比，TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細(xì)胞在S期時增殖率顯著下降，而在G0/G1期、G2/M期時增殖率升高(P<0.05)，TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，其中TE+AM組心肌成纖維細(xì)胞在G0/G1期、G2/M期增殖較TE組、AM組顯著，而TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達(dá)水平低于TE組、AM組。結(jié)論 替米沙坦聯(lián)合氨氯地平能有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖，其可能機(jī)制與抑制TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及p27蛋白過度表達(dá)有關(guān)。

替米沙坦；氨氯地平；血管緊張素Ⅱ；心肌成纖維細(xì)胞

心肌纖維化是心肌功能衰退的重要表現(xiàn)，與心源性猝死、心力衰竭及心律失常等多種終末期心臟病發(fā)生有密切的關(guān)系〔1〕。成纖維細(xì)胞活化是心肌纖維化的重要誘因，而在這過程中血管緊張素(Ang)Ⅱ起到重要的作用。Ang Ⅱ可刺激心肌膠原合成，促使成纖維細(xì)胞增殖，介導(dǎo)心肌纖維化〔2〕。近年有研究指出，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1異常表達(dá)是引起心肌纖維化的重要通路，在心肌纖維化中起到重要的作用〔3〕。替米沙坦屬于Ang Ⅱ受體拮抗劑，能有效預(yù)防心肌纖維化；氨氯地平可有效舒張血管，改善心肌供血并抑制心肌纖維化〔4〕。本研究將探討替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對AngⅡ誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞中TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 新生1～3 d Wistar 大鼠，雌雄不拘，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 新生胎牛血清(北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司)；DEME培養(yǎng)液(美國Sigma公司)；AngⅡ(北京方程生物科技有限公司)；胰蛋白酶消化液(北京索萊寶科技有限公司)；雙抗(青霉素+鏈霉素)；Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白試劑盒〔卡邁舒(上海)生物科技有限公司〕；p27蛋白試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)；TGF-β1(美國 HyClone 公司)；替米沙坦(生產(chǎn)日期：H201502036；北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司)；氨氯地平(批號：H201509123；蘇州第壹制藥有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 光學(xué)顯微鏡(型號：DMLP-MP30；日本RICOH公司)；微量移液器(20、200、1 000 μl)購自DragonMed公司；臺式微量離心機(jī)(型號H1650-W；美國Sigma公司)；高速冷凍離心機(jī)(型號：A1330103；美國Beckman公司)；臺式低溫高速離心機(jī)(型號:TD-35M/TD35；德國Hettich公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號：MCO-20AIC；德國Heraeus公司)；電子天平(BP211D型；Sartorius公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(型號：DG-3022型，國營華東電子管廠產(chǎn)品)；流式細(xì)胞儀(規(guī)格型號：1401-X-20R；貝克曼庫爾特有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 在無菌操作條件下取30只Wistar乳鼠，將其左心室取出并剪碎成1 mm3大小，應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗3次，依次加入0.01% Ⅱ型膠原酶、0.08%胰蛋白酶消化10 min，反復(fù)消化直至組織塊消失。收集懸浮液離心過濾后留取沉淀物，并置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。由于成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞生長時間不同，采用差速貼壁2 h獲得心肌成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞生長至滿瓶后應(yīng)用0.25% 胰酶消化傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3代后收集成纖維細(xì)胞。

1.4.2 心肌成纖維細(xì)胞鑒定 將傳代成纖維細(xì)胞接種至玻片中，待細(xì)胞爬滿玻片后，將玻片取出，PBS沖洗3遍，室溫下加入4% 多聚甲醛固定，恒溫水浴箱中孵育30 min，采用山羊血清封閉，室溫下以1∶50加入鼠抗波形蛋白抗體工作液恒溫孵育3 h，依次加入經(jīng)生物素標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液于室溫孵育。應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色，PBS沖洗，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水，中性樹脂封固，并于倒置顯微鏡下觀察心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)。

1.4.3 樣本分組及處理 對照組(加入15%小牛血清DEME培養(yǎng)液)，AngⅡ組(15%小牛血清DEME培養(yǎng)液+1×10-6mol/L AngⅡ)，替米沙坦組(TE組，在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦)，氨氯地平組(AM組，AngⅡ組基礎(chǔ)上加入1 μmol/L氨氯地平)、替米沙坦+氨氯地平組(TE+AM組，在AngⅡ組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L替米沙坦+1 μmol/L氨氯地平)，每組3份。

1.4.4 心肌成纖維細(xì)胞增長率測定 預(yù)處理各組細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定各組在G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞懸浮液，測定前以70%酒精固定細(xì)胞，加入500 μl碘化丙啶綜合染色，加蒸餾水至100 ml，室溫下放置30 min后上機(jī)檢測，重復(fù)操作3次。

1.4.5 免疫熒光法測定TGF-β1 蛋白 每組隨機(jī)抽取3張已制備好的心肌組織石蠟切片，酒精梯度脫水，PBS洗3遍，室溫下加入3% H2O2，常溫下孵育10 min抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3遍，明火低溫加熱8 min，待水溫下降至室溫后采用PBS洗滌3次，依次加入10%山羊血清常溫下孵育30 min，加入一抗4℃孵育過夜后PBS沖洗，加入熒光二抗，室溫避光孵育30 min，PBS沖洗。樣品制備完畢后于熒光分析儀下觀察細(xì)胞蛋白表達(dá)情況。

1.4.6 免疫組化法測定TGF-β1蛋白 取100 mg細(xì)胞搗碎，4℃ 14 000 r/min 離心10 min，留取上清液，準(zhǔn)確移取樣液10 μl加入SDS-PAGE凝膠電泳孔中，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入兔抗鼠TGF-β1與β-actin，4℃封閉過夜，應(yīng)用經(jīng)辣根過氧化氫酶標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白，曝光、掃描，計算蛋白表達(dá)量。

1.4.7 酶聯(lián)法測定Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白 酶聯(lián)反應(yīng)板每孔中依次加入100 μl待測樣品，加入100 μl一抗工作液，應(yīng)用PBS反復(fù)洗滌反應(yīng)板，37℃中恒溫加熱60 min，每孔加入100 μl酶標(biāo)抗體工作液，37℃下水浴加熱30 min，每孔加入100 μl終止液混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm處測定吸光值。

2 結(jié) 果

2.1 心肌成纖維細(xì)胞鑒定 在倒置顯微鏡下可觀察到心肌成

纖維細(xì)胞胞體較大，胞質(zhì)透明，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核呈橢圓形，通常含2～3個核，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，細(xì)胞純度高達(dá)98%，見圖1。

2.2 各組心肌成纖維細(xì)胞不同細(xì)胞時期增殖情況 與對照組相比，AngⅡ組心肌成纖維細(xì)胞在S期時增殖率較高，而在G0/G1期、G2/M期時增殖率下降(P<0.05)；與AngⅡ組相比，TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細(xì)胞在S期時增殖率顯著下降，而在G0/G1期、G2/M期時增殖率升高(P<0.05)，見表1。

2.3 免疫熒光法檢測 TGF-β1 蛋白表達(dá) 與對照組相比，AngⅡ組心肌組織中TGF-β1 蛋白熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，而TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細(xì)胞熒光強(qiáng)度依次減弱，見圖2。

圖1 倒置顯微鏡下觀察心肌成纖維細(xì)胞(×200)

組別G0/G1期S期G2/M期對照組70.23±1.2815.33±1.2017.33±2.12AngⅡ組57.22±2.451)33.58±4.691)9.33±2.451)TE組62.33±3.251)2)23.22±2.481)2)12.25±1.781)2)AM組62.98±3.351)2)23.69±2.381)2)12.63±1.691)2)TE+AM組65.98±2.181)2)3)4)19.33±3.141)2)3)4)14.66±2.021)2)3)4)

與對照組比較：1)P<0.05；與AngⅡ組比較：2)P<0.05；與TE組比較：3)P<0.05；與AM組比較：4)P<0.05

各圖右上為抗-TGF-β1免疫熒光，右下為 DAPI 染色核定位，左側(cè)為右上與右下重疊圖圖2 免疫熒光法檢測 TGF-β1 蛋白表達(dá)

2.4 免疫組化法測定TGF-β1 蛋白 與對照組相比，AngⅡ組心肌組織中TGF-β1 蛋白表達(dá)較強(qiáng)，而TE組、AM組及TE+AM組心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)隨劑量增加而減弱，條帶灰度依次減弱，見圖3和表2。

2.5 各組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及p27蛋白定量分析 如表2所示，與對照組相比，AngⅡ組心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與AngⅡ組相比，TE組、AM組及TE+AM組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，其中TE+AM組心肌成纖維細(xì)胞中TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、p27蛋白表達(dá)水平低于TE組、AM組(P<0.05)，見表2。

表2 各組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及p27蛋白定量分析

與對照組相比：1)P<0.05；與AngⅡ組相：2)P<0.05；與TE組相比：3)P<0.05；與AM組相比：4)P<0.05

圖3 免疫組化法測定TGF-β1 蛋白

3 討 論

心肌纖維化是多種心臟病的終末期表現(xiàn)，在多種血管活性物質(zhì)及促纖維化因子的作用下可激活多種細(xì)胞信號通路，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞過度增殖并引起膠原蛋白沉積，增加心室僵硬度，進(jìn)一步促進(jìn)心肌纖維化發(fā)生〔5〕。

Ang Ⅱ具有收縮血管作用，與Ang Ⅱ受體結(jié)合可促進(jìn)基底細(xì)胞底物磷酸化，并可通過酪氨酸酶途徑激活絲裂霉素活化蛋白酶，從而促進(jìn)及介導(dǎo)心肌成纖維化細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化，在心臟病終末期病變中起到重要的作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明AngⅡ可破壞細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)膠原蛋白沉積，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化〔6〕。

相關(guān)研究指出〔7〕，TGF-β1可通過誘導(dǎo)纖維連接蛋白、蛋白寡糖及纖維膠原等成分從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化。本研究結(jié)果與Wang等〔8〕一致，表明TGF-β1可通過介導(dǎo)信號通路從而誘發(fā)心肌成纖維細(xì)胞增殖。p27是TGF-β1及其細(xì)胞外因子誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯的主要介質(zhì)，在AngⅡ誘導(dǎo)下p27可參與血管、心臟細(xì)胞肥大，并可引起動脈粥樣硬化〔9〕。張平等〔10〕研究指出，AngⅡ可通過上調(diào)p27蛋白表達(dá)使得靜止期的血管平滑肌細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而介導(dǎo)細(xì)胞平滑肌增生。

替米沙坦作為新一代非肽類AngⅡ受體拮抗劑，能與AngⅡ受體結(jié)合從而阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)活性，抑制AngⅡ分泌〔11〕。宋占春等〔12〕研究認(rèn)為，替米沙坦能有效降低心肌病大鼠炎癥標(biāo)志物及心肌蛋白的表達(dá)，并能有效降低心肌相關(guān)膠原蛋白表達(dá)，抑制心肌纖維化。氯氨地平屬于鈣離子抑制劑，能有效改善心肌供血，降低心臟壓力負(fù)荷，抑制心肌膠原蛋白生成，進(jìn)而抑制心肌纖維化〔13〕。

本研究結(jié)果顯示替米沙坦聯(lián)合氯氨地平能有效抑制TGF-β1表達(dá)，阻斷Ⅰ、Ⅱ膠原蛋白、p27蛋白生成。這可能由于替米沙坦與氯氨地平聯(lián)合應(yīng)用時能起到藥物協(xié)同效果，能有效抑制RAS活性，從而抑制AngⅡ分泌，進(jìn)而改善心肌纖維化。

1 劉 源,唐其柱,李利娜,等.橙皮素對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原蛋白合成的抑制作用〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志,2014；94(36):2852-6.

2 阮 滔,何學(xué)華,劉麗萍,等.黃芪對心肌成纖維細(xì)胞增殖及分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β1的影響〔J〕.臨床兒科雜志,2015;33(3):284-6.

3 胡哲夫,唐其柱,劉 源,等.橙皮素對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響〔J〕.疑難病雜志,2015;14(4):376-9.

4 馬香芹,黃顯峰,盧澤愷,等.替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對腎性高血壓大鼠左室重構(gòu)的對比研究〔J〕.天津醫(yī)藥,2013;43(11):1114-6.

5 曾 翼,趙 誠,王 霏,等.二苯乙烯苷對TGF-β1誘導(dǎo)新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響及其機(jī)制〔J〕.中國藥科大學(xué)學(xué)報,2014;45(3):362-7.

6 Ding Y,Peng Y,Li J,etal.Gualou Xiebai Decoction prevents myocardial fibrosis by blocking TGF-beta/Smad signalling〔J〕.J Pharm Pharmac,2013;65(9):45-8.

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8 Wang W,Wang B,Lu Q,etal.Inhibition of high-mobility group box 1 improves myocardial fibrosis and dysfunction in diabetic cardiomyopathy〔J〕.Int J Cardiol,2014;172(1):45-8.

9 Lu Y,Liu J,Bi X,etal.Pyridostigmine ameliorates cardiac remodeling induced by myocardial infarction via inhibition of the transforming growth factor-β1/tgf-β1- activated kinase pathway〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol,2014;63(5):82-8.

10 張 平,張再偉,邵 靚,等.TGF-β1、CTGF對慢性心衰心肌纖維化進(jìn)展的臨床意義〔J〕.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014;35(11):45-7.

11 Krmer J,Niemann M,Liu D,etal.Two-dimensional speckle tracking as a non-invasive tool for identification of myocardial fibrosis in Fabry disease〔J〕.Eur Heart J,2013;34(21):45-8.

12 宋占春,白靜慧,張麗莉,等.替米沙坦對大鼠急性心肌梗死后炎癥反應(yīng)及纖維化的干預(yù)機(jī)制〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志,2014;94(33):2628-33.

13 Li M,Jiang Y,Jing W,etal.Quercetin provides greater cardioprotective effect than its glycoside derivative rutin on isoproterenol-induced cardiac fibrosis in the rat〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2013;91(11):120-4.

〔2016-04-12修回〕

(編輯 李相軍)

河南省2014年基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(142300410467)

楊紅梅(1969-)，女，碩士，教授，主要從事氧化與抗氧化研究。

馬香芹(1977-)，女，碩士，副教授，主要從事心血管藥理學(xué)研究。

R969.4

A

1005-9202(2016)20-4963-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.010