紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖與凋亡的影響

馬永臻

(山東醫學高等專科學校，山東 臨沂 276000)

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紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖與凋亡的影響

馬永臻

(山東醫學高等專科學校，山東 臨沂 276000)

目的 探討紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖與凋亡。方法 用劃痕實驗檢測紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖、遷移能力的影響；MTT法和免疫細胞化學方法檢測紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響。結果 紫杉醇和順鉑明顯抑制KYSE150細胞的增殖，降低其遷移能力(P<0.05)，且兩藥有協同抑制作用。紫杉醇和順鉑降低KYSE150細胞中Bcl-2蛋白的表達，增強Bax和Caspase-3蛋白的表達(P<0.05)。結論 紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖和凋亡影響與Bax、Bcl-2和Caspase-3基因表達異常相關。

紫杉醇；順鉑；Bax；Bcl-2；Caspase-3；食管癌

早期食管癌的治療以手術切除為主，晚期常以化療為主，但食管癌發病隱匿，確診時大多已是中晚期，失去了根治的機會，導致食管癌治療的總有效率并不高。因此，尋找對食管癌更有效的治療方法和化療藥物具有重要意義。紫杉醇和順鉑是臨床常用的食管癌化療藥物，但對其作用機制尚未完全清楚。食管癌的發生、發展與細胞凋亡異常密切相關，而細胞凋亡又是由多種基因調控的，研究凋亡調控基因對于了解食管癌的發生、發展及治療都有重要意義。本文觀察紫杉醇和順鉑對食管癌KYSE150細胞增殖和凋亡的影響，檢測Bax、Bcl-2和Caspase-3基因表達變化，探紫杉醇和順鉑的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI1640培養液、胰蛋白酶和胎牛血清由杭州四季青公司提供。人食管癌KYSE150株由本實驗室凍存。紫杉醇(分子量853.9)、順鉑(分子量300.05)由哈藥集團生物工程有限公司提供，5%四甲基偶氮唑藍(MTT)由上海華美生物工程公司提供。兔抗人Bax、Bcl-2和Caspase-3單克隆抗體由美國Santa Cruz公司提供，FITC標記的羊抗兔IgG、山羊封閉血清、二甲基亞砜(DMSO)、DAB顯色劑和PBS購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 細胞培養 KYSE150細胞接種于RPMI1640培養基(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素)，常規培養，隔天更換培養液并傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 MTT法檢測

1.3.1 半數抑制濃度(IC50)測定 取100 μl含5×104個/ml細胞接種于96孔板。孵育12 h后，加入不同濃度的順鉑和紫杉醇，順鉑終濃度依次為4、8、16、32、64、128、256 μg/ml，紫杉醇終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml，每孔100 μl，每個濃度設3個復孔，以不含藥物的培養液作為陰性對照孔，同樣設3個復孔。繼續培養48 h后加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl/孔，孵育4 h，吸去孔內培養液，加150 μl DMSO，振蕩10 min。用全自動酶標儀測定490 nm處吸光值(A)。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A)×100%。計算出順鉑、紫杉醇對人食管癌細胞KYSE150的IC50。實驗重復3次。

1.3.2 藥物聯合作用評價 細胞分如下4組：對照組、紫杉醇組、順鉑組和聯合組(紫杉醇+順鉑)，對照組不加藥物，紫杉醇和順鉑的濃度均為IC50。倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態；全自動酶標儀檢測藥物作用24、48、72 h后各組細胞的吸光值，比較不同藥物和用藥方式對KYSE150細胞增殖的影響。實驗重復3次。采用兩藥相互作用指數(CDI)評價兩藥的相互作用〔1〕：CDI=AB/(A×B)，其中A、B是兩藥單獨作用吸光度值與對照組吸光度值的比值，AB為兩藥聯合組吸光度值與對照組吸光度值比值。CDI>1時，兩藥相互作用為拮抗作用；CDI=1，兩藥作用性質為相加；CDI<1時，兩藥相互作用為協同。

1.4 免疫細胞化學染色 KYSE150細胞按照1.3.2方法分組培養，至細胞完全貼壁后加紫杉醇和順鉑(均為IC50的濃度)。繼續培養48 h后收集細胞，涂片，固定，3%H2O2室溫孵育15 min，山羊血清孵育15 min。分別與Bax、Bcl-2和Caspase-3單克隆抗體37℃孵育2 h，PBS洗3次。二抗室溫孵育15 min，DAB顯色，封片，以培養液代替一抗作陰性對照。顯微鏡下觀察切片，以細胞膜和細胞質中出現棕黃色細顆粒為陽性細胞，比較各組細胞陽性著色的位置和強度，計算KYSE150細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的陽性率。應用Image J軟件和Image Proplus軟件對免疫組化圖像進行半定量分析。

1.5 劃痕實驗檢測紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞生長和遷移的影響 取對數期各組細胞接種于6孔板，細胞密度為5×103個/孔，待細胞貼壁成單層細胞后，用消毒槍頭均勻劃4條橫線，用PBS洗去劃下的細胞，換成含1.5%胎牛血清的培養基培養，置于37°C，5%CO2孵箱內培養。顯微鏡下觀察0、24、48 h劃痕愈合情況，用Image Proplus軟件測量各組細胞24 h的遷移距離，每組實驗重復3次。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 IC50測定 見表1。隨著紫杉醇和順鉑濃度增加，KYSE150細胞的抑制率也增加，當紫杉醇濃度為8 μg/ml、順鉑的濃度為64 μg/ml時，細胞的抑制率近半數，因此，可以認為紫杉醇的IC50為8 μg/ml，順鉑的IC50為64 μg/ml。

表1 紫衫醇和順鉑IC50測定

2.2 紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖的影響 顯微鏡下觀察，紫杉醇組、順鉑組和聯合組細胞稀疏，形態皺縮、變圓，胞核固縮；對照組細胞密集，貼壁良好，形態規則，多邊形。說明紫杉醇和順鉑對食管癌細胞有明顯的抑制作用。紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖抑制作用并無時間依賴性，48 h時抑制作用最強(CDI=0.742)，72 h后抑制作用減弱(CDI=0.922),24 h時CDI=0.878；各時間點CDI<1，說明紫杉醇和順鉑有協同作用，而且48 h協同作用最強。見表2。

表2 紫杉醇和順鉑作用不同時間的平均吸光度值比較

與同組別其他時間點比較：1)P<0.05;與同時間點其他組比較：2)P<0.05

2.3 免疫細胞化學結果 各組平均灰度值見表3，各用藥組Bcl-2蛋白的表達均低于對照組，Bax和Caspase-3蛋白的表達均高于對照組。應用Image J軟件對免疫組化圖像進行陽性細胞計數，見表4，陽性細胞越多，說明表達Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達越多(P<0.05)。

表3 Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的平均灰度值

與對照組比較:1)P<0.05，下表同

表4 免疫組化圖像陽性細胞數分析(%,n=100)

2.4 劃痕實驗結果 劃痕實驗結果顯示，對照組細胞生長較快，48 h后細胞已經長滿劃痕部位，而順鉑組細胞生長緩慢，48 h后劃痕部位沒有長滿。用Image Proplus軟件測量各組細胞24 h的遷移距離，結果表明對照組遷移距離明顯大于順鉑組(P<0.05)，見表5。

表5 各組細胞24 h、48 h遷移距離

3 討 論

紫杉醇和順鉑已經廣泛應用于食管癌的治療，效果較好〔2,3〕。本研究發現，隨著紫杉醇和順鉑濃度的增加，對KYSE150細胞的抑制作用增強，當紫杉醇濃度為8 μg/ml、順鉑的濃度為64 μg/ml時，細胞的抑制率近半數，但紫杉醇和順鉑的抑制作用并無時間依賴性，48 h時抑制作用最強，72 h后抑制作用減弱，而且紫杉醇和順鉑有協同作用。章曉萍等〔4〕研究發現，順鉑與吉非替尼聯合用藥對食道癌Eca-109細胞有協同抑制作用，細胞的生長抑制率均隨著給藥濃度的增加和時間的延長而提高,順鉑組具有時間濃度依賴性,與本研究略有不同之處。

細胞增殖失控是惡性腫瘤重要的生物學特征，細胞增殖與凋亡失衡是食管癌發生的重要原因，細胞凋亡又受許多基因的調控，其中Bax、Bcl-2和Caspase-3都與細胞凋亡有關。孔霞等〔5〕研究證實，順鉑與紫杉醇聯合可協同誘導人食管癌細胞的凋亡，其作用機制可能與下調凋亡抑制基因的表達有關。原癌基因Bcl-2基因家族及其相關蛋白是研究最早的與凋亡有關的基因，也是目前最受重視的調控細胞凋亡的基因家族〔6〕。Bcl-2家族成員分為兩大類：促凋亡類，如Bid、Bax、Bak等；抑凋亡類，如Bcl-2、Bcl-x1等，這2類蛋白可通過形成異二聚體發揮相互拮抗或協同作用〔7〕。Bcl-2基因高表達可以抑制細胞凋亡，維持細胞的存活，而對細胞增殖無影響。

Bax基因定位于染色體19q13.3-19q13.4,含有6個外顯子5個內含子。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡，當Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡；Bax與Bcl-2形成異源二聚體時則實現了Bcl-2抑制細胞凋亡的功能〔7〕。

本研究說明紫杉醇和順鉑使得Bcl-2蛋白表達降低，Bax和Caspase-3的表達增高，對KYSE150細胞凋亡的抑制作用減弱，誘導凋亡的作用增強，從而抑制細胞的增殖，抑制食管癌的進一步發展。這一結果與某些實驗結果一致〔8,9〕。

細胞凋亡是非常復雜的蛋白酶級聯反應過程。目前認為藥物誘導腫瘤細胞的凋亡受一個或多個基因的調控〔10〕。眾所周知，Caspase-3為與細胞凋亡密切相關的蛋白酶家族〔11〕。誘導細胞凋亡的典型途徑包括：對Caspase-3的依賴性(細胞外途徑)和對線粒體靶向性(細胞內途徑)，而Caspase-3是兩種細胞凋亡途徑中的關鍵酶和執行者，是級聯反應的必經之路。由于活化的Caspase-3能特異性地切斷DNA，使參與DNA損傷修復過程中的DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)和聚ADP核糖聚合酶(PARP)失活，導致核酸激活和染色質聚集，促使細胞凋亡。Odonkor等〔12〕研究結果表明，Caspase-3依賴性途徑是Paclitaxel細胞毒性作用的重要途徑，Caspase活化和效能對Paclitaxel治療腫瘤的敏感性具有良好的指示作用。劉圓圓等〔13〕研究發現茶多酚能抑制Eca-109細胞生長、誘導細胞凋亡，使細胞周期阻滯在G1期的比例增高；兩藥聯合其作用更明顯，其機制可能與Caspase-3 mRNA表達增高有關。從作用機制而言，Bcl-2不僅可能通過抑制細胞色素C從線粒體的釋放而調控線粒體滲透性轉換孔的開啟從而抑制Caspase-3的活化，還可能參與抑制Caspase-3的合成〔14〕。

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5 孔 霞,王秀美,隋愛華，等.重組人血管內皮抑素與紫杉醇聯合誘導人食管癌細胞 Eca-109 凋亡的實驗研究〔J〕.臨床腫瘤學雜志,2013；18(3):193-6.

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12 Odonkor CA,Achilefu S.Differential activity of caspase-3 regulates susceptibility fo lung and breast tumor celllines to Paclitaxel〔J〕.Open Biochem J,2008；2(22):121-8.

13 劉圓圓，王秀美，姚如永，等.茶多酚并紫杉醇對食管癌Eca-109細胞增殖與凋亡影響〔J〕.齊魯醫學雜志,2013；28(2):102-5.

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〔2015-04-15修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

山東省醫藥衛生科技發展計劃(2011HZ098)

馬永臻(1970-)，女，碩士，教授，主要從事腫瘤病理研究。

R735.1

A

1005-9202(2016)20-4973-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.014