骨痹顆粒防治兔骨關(guān)節(jié)炎的作用及機制

周玲玲 劉 慧 周 聰 耿 姍 周學平

(南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023)

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骨痹顆粒防治兔骨關(guān)節(jié)炎的作用及機制

周玲玲 劉 慧 周 聰 耿 姍 周學平

(南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023)

目的 觀察骨痹顆粒對兔骨關(guān)節(jié)炎(OA)的治療作用機制。方法 兔隨機分為正常對照組、模型組、塞來昔布組及骨痹顆粒2.78，5.56，11.12 g生藥/kg三個劑量組；采用兔關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶法建立OA模型，連續(xù)給藥8 w，檢測家兔血清中白細胞介素(IL)-1β、前列腺素(PG)E2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1含量及關(guān)節(jié)液中誘導型一氧化碳合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)水平，觀察兔關(guān)節(jié)病理組織學變化。結(jié)果 骨痹顆粒5.56，11.12 g生藥/kg可抑制炎癥因子IL-1β及PGE2的生成，降低MMP-1及MMP-3水平，提高TIMP-1水平，抑制關(guān)節(jié)液中iNOS表達及NO釋放，減輕關(guān)節(jié)軟骨病變，降低關(guān)節(jié)Mankin評分。結(jié)論 骨痹顆粒對兔OA具有良好的治療作用，其機制與抑制炎癥介質(zhì)和炎性因子生成、調(diào)節(jié)基質(zhì)合成與分解代謝平衡有關(guān)。

骨痹顆粒；骨關(guān)節(jié)炎；炎性因子；金屬蛋白酶

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是機械力學和生物學事件的共同作用下所導致的關(guān)節(jié)的軟骨細胞、細胞外基質(zhì)(ECM)，及軟骨下骨的降解和合成作用之間失衡的結(jié)果〔1〕，流行病學調(diào)查結(jié)果顯示50歲以上人群OA致殘率在長期致殘疾病排名中僅次于心血管疾病〔2〕，因此，OA的防治也成為醫(yī)學界研究的熱點。中醫(yī)藥在防治骨關(guān)節(jié)疾病方面具有獨特療效，周仲瑛教授結(jié)合臨床應(yīng)用數(shù)十年的經(jīng)驗，采用桑寄生、懷牛膝、川斷等8味中藥，通過現(xiàn)代方法精制成骨痹顆粒，臨床研究證明該藥可有效抑制炎癥，延緩關(guān)節(jié)退變，減輕患者痛苦。為了進一步明確其對OA的療效，本課題采用關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶建立家兔骨關(guān)節(jié)炎的模型，觀察骨痹顆粒對其作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 骨痹顆粒由江蘇省植物藥研究與新藥開發(fā)中心提供，含6 g生藥/g；塞來昔布，輝瑞制藥有限公司；兔IL-1β、前列腺素(PG)E2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒，均購自上海源葉生物科技有限公司；一氧化氮(NO)及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器 Synergy HT型酶標儀，美國Bio-Tek公司；TS25-WS型離心機，上海盧湘儀儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 骨關(guān)節(jié)炎模型的建立〔3,4〕將兔固定于兔臺，膝關(guān)節(jié)備皮，消毒并屈曲右膝關(guān)節(jié)，于髕韌帶附著點外上方約 0.5 cm處進針，將0.3 ml 1.6%木瓜蛋白酶注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，每隔3 d注射1次，共注射3次。正常對照組注射等體積的生理鹽水。

1.3.2 分組及給藥 家兔48只，體重2～2.5 kg，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(蘇)2012-0008。雌雄各半，隨機分為6組：分別為①正常對照組；②模型組；③塞來昔布組：7.67 mg/kg；④骨痹顆粒低劑量組：2.78 g生藥/kg；⑤中劑量組：5.56 g生藥/kg；⑥高劑量組：11.12 g生藥/kg。各組于造模完成后次日開始分別灌胃給予相應(yīng)的藥物，給藥體積為3 ml/kg，正常對照組和模型組給予等體積生理鹽水，每日1次，共8 w。

1.3.3 指標檢測 給藥結(jié)束后各組家兔心臟取血，離心取血清，ELISA法檢測血清中IL-1β、PGE2、MMP-1、MMP-3、TIMP-1的含量；處死家兔，用注射器抽取1 ml生理鹽水，注入關(guān)節(jié)腔，反復屈膝后抽取關(guān)節(jié)液，離心后測定關(guān)節(jié)液中NO及iNOS含量；取造模側(cè)關(guān)節(jié)股骨內(nèi)髁固定，常規(guī)處理，切片，行HE染色作病理組織學檢查，阿爾新蘭染色觀察基質(zhì)染色情況，并按照Mankin評分標準進行評分〔5〕。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用Graph Pad Prism 5軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 骨痹顆粒對OA兔血清中IL-1β、PGE2含量的影響 模型組較正常對照組兔血清中IL-1β、PGE2含量均顯著升高(P<0.01)，骨痹顆粒中、高劑量組與模型組比較，血清中IL-1β、PGE2含量均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且存在一定的劑量依賴性。見表1。

表1 骨痹顆粒對OA兔血清IL-1β、PGE2含量的影響

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

2.2 骨痹顆粒對OA兔血清MMP-1、MMP-3、TIMP-1含量的影響 模型組兔血清中MMP-1、MMP-3含量較正常對照組明顯升高，TIMP-1含量較正常對照組明顯降低(P<0.01)，骨痹顆粒中、高劑量組血清MMP-1、MMP-3含量較模型組明顯降低，TIMP-1含量較模型組明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 骨痹顆粒對兔血清MMP-1、MMP-3、TIMP-1含量的影響

2.3 骨痹顆粒對OA兔關(guān)節(jié)液NO、iNOS含量的影響 模型組兔關(guān)節(jié)液NO、iNOS含量較正常對照組明顯升高(P<0.01)；骨痹顆粒低劑量組兔關(guān)節(jié)液NO含量明顯低于模型組(P<0.05)，但iNOS含量變化較模型組無明顯降低；骨痹顆粒中、高劑量組兔關(guān)節(jié)液NO 、iNOS含量較模型組均有顯著下降(P<0.01)。見表3。

表3 骨痹顆粒對兔關(guān)節(jié)液NO 、iNOS含量的影響

2.4 骨痹顆粒對OA兔關(guān)節(jié)軟骨病理組織學改變的影響 家兔關(guān)節(jié)病理組織學檢查結(jié)果顯示：正常對照組兔關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，無裂隙，分層規(guī)則，細胞排列整齊，潮線清晰完整。模型組兔關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙不平，出現(xiàn)裂隙，分層不清晰，結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨細胞中度或重度增生，伴有大量簇集現(xiàn)象，潮線模糊，或被血管穿過。骨痹顆粒低劑量組兔關(guān)節(jié)軟骨細胞排列紊亂但層次可分，軟骨細胞輕度至中度增生，部分有簇集現(xiàn)象，局部區(qū)域缺失，潮線紊亂；中劑量組兔關(guān)節(jié)軟骨表面較平滑，有少許裂隙排列紊亂但層次可分，軟骨細胞排列整齊，輕度增生，潮線完整，可見多層次潮線；高劑量組兔關(guān)節(jié)軟骨表面較平滑，分層基本清楚，細胞輕度增生，潮線清晰可見。見圖1。兔軟骨Mankin評分結(jié)果顯示：模型組兔關(guān)節(jié)Mankin′s評分較正常對照組明顯升高〔(8.00±1.31)vs(0.00±0.00)，P<0.01〕；骨痹顆粒中、高劑量組兔關(guān)節(jié)Mankin評分〔(6.25±1.83)，(6.13±1.55)〕較模型組明顯降低(P<0.05)。塞來昔布組、骨痹顆粒低劑量組〔(6.57±2.07)、(7.50±1.52)〕與模型組無顯著差異(P>0.05)。

圖1 各組兔關(guān)節(jié)病理組織學改變(HE，×40)

3 討 論

OA主要病理改變?yōu)檐浌峭诵行圆∽儭⒒|(zhì)降解、骨贅形成等。周仲瑛教授根據(jù)數(shù)十年臨床經(jīng)驗確立補腎蠲痹通絡(luò)法治療OA〔6〕，據(jù)此選藥組成骨痹方。方中桑寄生益肝腎、祛風濕、強筋骨，雞血藤養(yǎng)肝血、柔筋脈、和血絡(luò)，兩者共為君藥。懷牛膝、川斷、骨碎補共為臣藥，補肝腎、強筋骨、活血止痛，增強桑寄生補肝腎、強筋骨的功效。千年健和土鱉蟲共為佐藥，祛風濕、破瘀血、壯筋骨、止痛消腫；油松節(jié)祛風濕、通絡(luò)止痛，善走骨節(jié)、直達病所為使藥。諸藥合用共奏平補肝腎、蠲痹通絡(luò)之功效，可延緩關(guān)節(jié)軟骨的退行性變，充分體現(xiàn)治病求本之旨。

課題首先采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射誘發(fā)兔OA，動物可觀察到關(guān)節(jié)病變，炎癥性細胞因子過度分泌和金屬蛋白酶水平異常等癥狀，與人骨關(guān)節(jié)炎病理變化較為類似。在此基礎(chǔ)上觀察骨痹顆粒的作用，結(jié)果顯示其可以減輕兔骨關(guān)節(jié)病理組織學改變，降低Mankin評分，表明其對OA的局部病變有較好的作用。細胞因子的合成與分解途徑的失衡是OA關(guān)節(jié)軟骨毀損中最為基本的因素，其中IL-1β的大量釋放，可刺激軟骨細胞和滑膜產(chǎn)生MMPs，促進軟骨基質(zhì)的降解，還可誘導環(huán)氧化酶(COX)-2和iNOS的表達，促進PGE2、NO的合成〔7,8〕。PGE2可增加毛細血管通透性，抑制蛋白多糖合成，激活MMPs，并促進膠原酶產(chǎn)生，導致軟骨基質(zhì)降解破壞〔9,10〕。此外，PGE2對IL-1β的表達具有正反饋的作用，從而進一步誘導軟骨細胞凋亡〔11〕。高水平的NO在OA可促進PGE2釋放，加重炎癥反應(yīng)，誘導軟骨細胞凋亡，還能激活多種潛在的膠原酶、明膠酶和組織纖溶酶原激活物，抑制軟骨基質(zhì)合成，促進Ⅱ型膠原降解，最終導致軟骨進行性退化〔12,13〕。本研究結(jié)果顯示，骨痹顆粒能夠明顯抑制OA兔血清中IL-1β、PGE2等炎癥因子的產(chǎn)生，并進一步抑制兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)iNOS的過度表達，減少NO的分泌，提示抑制炎癥性細胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放是其治療OA的機制之一。

細胞外基質(zhì)主要由膠原與蛋白多糖構(gòu)成，是軟骨的主要組成部分，在維持軟骨功能方面有著重要的作用，其合成與降解代謝保持動態(tài)平衡〔14〕。MMPs是基質(zhì)降解的主要介質(zhì)，其中MMP-1和MMP-3是參與軟骨基質(zhì)降解的重要介質(zhì)，并受TIMP-1的調(diào)節(jié)〔15〕，目前已作為判斷療效的指標之一。本課題研究結(jié)果表明骨痹顆粒可改善基質(zhì)代謝平衡，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。炎癥因子IL-1β等的升高，也可刺激軟骨及滑膜MMPs表達上調(diào)，TIMPs表達下調(diào)，導致MMPs/TIMPs的平衡遭到破壞，因此推測骨痹顆粒對MMP的作用除直接作用外，還可能與其抑制炎癥因子的作用相關(guān)。

綜上，骨痹顆粒可保護OA動物的關(guān)節(jié)軟骨，延緩軟骨退變的發(fā)生與發(fā)展，抑制炎癥因子的生成，調(diào)節(jié)基質(zhì)代謝平衡，對OA具有良好的防治作用。

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〔2015-05-25修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

江蘇省科技廳社會發(fā)展項目(No.BE2011847)

周玲玲(1974-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事中藥藥理學、免疫藥理學等方面研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)20-4975-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.015