寧癇顆粒聯合卡馬西平對難治性癲癇模型大鼠炎癥反應的影響

薛 韜 仝秀清

(內蒙古醫科大學附屬醫院神經內科，內蒙古 呼和浩特 010059)

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寧癇顆粒聯合卡馬西平對難治性癲癇模型大鼠炎癥反應的影響

薛 韜 仝秀清

(內蒙古醫科大學附屬醫院神經內科，內蒙古 呼和浩特 010059)

目的 探討寧癇顆粒聯合卡馬西平對難治性癲癇模型大鼠炎癥反應的抑制作用。方法 SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、寧癇顆粒組、卡馬西平組以及聯合組，采用海馬CA3局部注射海人酸方法制作大鼠癲癇模型，造模后用苯妥英鈉灌胃14 d對模型進行篩選。繼續飼養2 w后股動脈取血并分離血清，檢測各組大鼠血清中白細胞介素(IL)-1β、IL-6及促炎因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的含量變化。結果 模型組中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達均明顯高于正常對照組(P<0.05)；寧癇顆粒組和卡馬西平組中三種因子表達顯著下降(P<0.05)，且聯合組中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達下降最顯著(P<0.05)。結論 寧癇顆粒聯合卡馬西平具有明顯的免疫抑制作用，比兩藥單用效果突出。推測兩藥可能通過協同作用抑制炎癥反應進而阻斷癲癇發作，達到治療癲癇的目的。

難治性癲癇；寧癇顆粒；卡馬西平

癲癇(epilepsy)是大腦神經元突發性異常持續放電，導致短暫大腦功能障礙的一種慢性疾病〔1〕。盡管目前多數癲癇發作經藥物治療可得到控制，但有部分患者對抗癲癇藥物治療反應差，癲癇發作難以控制，稱為難治性癲癇(IE)。雖然通過外科手術可以控制癲癇發作，但仍然有大約半數的IE患者外科治療無效或無手術適應證。最新研究發現癲癇病理機制與炎癥反應息息相關，而臨床上，激素和免疫球蛋白也已經用于IE的治療〔2〕。但迄今為止，對IE患者血清非特異性炎癥指標的研究極為有限。本實驗通過檢測IE模型大鼠血清中白細胞介素(IL)-1β、IL-6及促炎因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的含量間接反映IE大鼠炎癥反應發展程度，探究寧癇顆粒聯合卡馬西平對IE大鼠免疫機制方面的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康清潔級雄性SD大鼠100只。動物生產許可證號：SCXK(豫)2015-18。造模前每組均以大鼠標準飼料(鄭州大學第一附屬醫院動物實驗中心提供)喂養，自由飲水，適應性喂養至體重(250±20)g后進行造模及后續實驗。

寧癇顆粒藥物組成：青黛、石菖蒲、全蝎，均購于鄭州大學第一附屬醫院中藥房。卡馬西平片(江蘇恩華藥業，生產批號：H321502);苯妥英鈉片(北京雙鶴藥業股份有限公司，生產批號：H19621702)；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，生產批號：S10J0351。

1.2 方法

1.2.1 IE模型大鼠制備 10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后，將頭部固定于腦立體定位儀上，剪毛、酒精消毒，沿大鼠頭部正中線作1 cm的縱向切口，3%雙氧水腐蝕顱骨上腱膜及顱骨外膜，暴露前囟和冠狀縫。選擇右側海馬CA3中心區(AP:-4.00 mm,ML:4.40 mm,DV:3.8 mm)作為藥物注射靶點。用顱骨鉆小心鉆透顱骨至硬腦膜，不要傷及皮層，在鉆孔處用微量注射器注入2 μl海人酸(0.5 μg/μl)，微量注射器下針至硬腦膜下3.8 mm，在10 min內緩慢將海人酸注入右側海馬CA3中心區，留針5 min，鐘表螺絲封口，在對應的左側區域鉆孔上鐘表螺絲，并用牙科水泥封口，將電極接在鐘表螺絲上面，術后縫合頭皮。正常對照組除用生理鹽水代替海人酸外，其他操作相同。待癲癇模型制作完成后，以苯妥英鈉(0.03 g/kg,1.2 mg/ml)口服給藥14 d，行為學觀察大鼠仍有部分復雜性發作，腦電圖記錄有癲癇波者，證實IE大鼠造模成功。

1.2.2 分組及給藥 IE大鼠模型制備過程中死亡7只，24只因癲癇發作情況不符合要求而棄用。剩余符合條件的大鼠隨機分為模型組、寧癇顆粒組、卡馬西平組以及聯合組各9只，且每組給予相對應的藥物(按照臨床常用飲片劑量折算)灌胃14 d進行干預，正常對照組和模型組給予等量的生理鹽水作為對照。

1.2.3 檢測指標 采用股動脈取血法收集各組大鼠動脈血5 ml于真空抗凝采血管，4℃，4 000 r/min低溫離心15 min，分離取上清液，采用ELISA方法，嚴格按照相應ELISA試劑盒操作說明，檢測各組大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和促炎因子TNF-α的含量變化。

1.3 統計學方法 應用SPSS18.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行t檢驗。

2 結 果

與正常對照組相比，模型組炎癥因子IL-1β、IL-6和促炎因子TNF-α的表達顯著升高。單用寧癇顆粒或卡馬西平進行藥物干預后，三種因子的表達較模型組均有所下降，但聯合組干預后對三種因子的抑制最明顯(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

1)與正常對照組比較，2)與模型組比較，3)與寧癇顆粒組比較，4)與卡馬西平組比較：均P<0.05

3 討 論

癲癇的發病機制至今尚未闡明，越來越多的研究表明，炎癥過程與癲癇的發作密切相關〔3，4〕。對IE患者術后腦組織神經病理切片檢測發現，腦內存在一種持續且復雜的炎癥反應〔5〕。在動物實驗中發現，腦部炎癥反應和癲癇進程之間互為因果〔6〕。現已證實高遷移率族蛋白1/Toll樣受體4(HMGB1/TLR4)信號通路與IE密切相關，激活HMGB1/TLR4 通路主要生成與釋放炎癥因子IL-6、IL-1β以及促炎因子TNF-α 等細胞因子〔7〕。TLR4可與巨噬細胞、中性粒細胞分泌的HMGB1結合，促使核因子(NF)-κB活化誘導炎癥發生，激活后可通過NF-κB信號途徑生成并釋放大量的促炎細胞因子，促炎因子又可以反過來促進HMGB1 的分泌，造成癲癇反復發作，預后不良〔8〕。故IL-6,IL-1β和TNF-α逐漸被采用作為判斷癲癇發作的血清標志物。

IL-1β、IL-6以及TNF-α表達于激活的星形膠質細胞以及小膠質細胞上，在癲癇發作的腦內可檢測到上述炎性因子的受體表達明顯上調〔9〕。IL-1β在腦內的含量增高可加重炎癥反應，引起驚厥。IL-6的過量表達可以促進小鼠海馬的星形膠質細胞增生，引起海馬區腦電圖呈癲癇樣改變〔10〕。TNF-α可以誘導T、B淋巴細胞的活化，介導腦局部組織的炎癥反應，加劇IL-1β、IL-6對內皮細胞的損傷及血腦屏障的損害程度，誘導癲癇的發生〔11〕。有研究表明，IL-1β、IL-6、TNF-α對癲癇的反復發作和加劇起促進作用；同時，癲癇引起的炎癥因子也會加重IE的發作與反復〔12〕。本文采用海人酸誘導大鼠IE后，檢測發現模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均明顯升高，表明免疫細胞處于活化狀態，以上三種細胞因子參與了IE大鼠的異常免疫應答，從而導致細胞因子網絡失衡，進而引起細胞免疫功能紊亂。卡馬西平和寧癇顆粒可能是通過直接或間接作用于HMGB1/TLR4 信號通路，抑制TLR4的活性，進而減弱其與巨噬細胞和中性粒細胞分泌的HMGB1結合，導致HMGB1/TLR4 信號途徑生成與釋放的IL-1β、IL-6以及TNF-α含量下降，從而抑制炎癥反應，阻止腦損傷，起到保護腦細胞的作用。本研究中卡馬西平和寧癇顆粒單獨應用的療效弱于聯合應用組，推測卡馬西平和寧癇顆粒都只是干預HMGB1/TLR4 信號途徑的某一局部反應，而兩藥聯合應用后全面抑制整條通路，促使炎癥因子的表達下降更為明顯。

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〔2015-11-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

仝秀清(1971-)，女，碩士，主任醫師，主要從事神經電生理方面的研究。

薛 韜(1978-)，男，碩士，主治醫師，主要從事癲癇方面的研究。

R74

A

1005-9202(2016)20-4985-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.019