CD44s、CD44v6、CD44v9在骨肉瘤、骨巨細胞瘤及骨軟骨瘤標本的表達及臨床意義

王志濤 杜珍武 張桂珍 王亞軍

(吉林大學第二醫院骨科，吉林 長春 130041)

?

CD44s、CD44v6、CD44v9在骨肉瘤、骨巨細胞瘤及骨軟骨瘤標本的表達及臨床意義

王志濤 杜珍武 張桂珍 王亞軍

(吉林大學第二醫院骨科，吉林 長春 130041)

目的 探究變異體CD44s、CD44v6及CD44v9與骨肉瘤分化、轉移及惡性程度的關系。方法 通過qPCR技術檢測10例骨肉瘤、8例骨巨細胞瘤、5例骨軟骨瘤標本中變異體CD44s、CD44v6及CD44v9的表達水平，應用統計學方法進行數據處理，同時結合患者臨床資料和病理資料進行相關性分析。結果 (1)CD44s、CD44v6在骨肉瘤和骨巨細胞瘤中的表達明顯高于骨軟骨瘤(均P<0.05)，但在骨肉瘤和骨巨細胞瘤之間的表達無顯著差異(均P>0.05)。(2)CD44v9在骨軟骨瘤中無表達，在骨肉瘤和骨巨細胞瘤之間的表達無顯著差異(P>0.05)。(2)CD44v9在低分化骨肉瘤表達高于高分化骨肉瘤(P<0.05)，在轉移性骨肉瘤表達高于非轉移性骨肉瘤(P<0.05)，而CD44s和CD44v6與骨肉瘤分化和轉移無顯著相關性(P>0.05)。結論 CD44s、CD44v6及CD44v9在不同骨腫瘤之間表達有差異。CD44s、CD44v6及CD44v9三者當中只有CD44v9的表達與骨肉瘤的分化和轉移有相關性，并且分化和轉移關系密切。CD44v9可作為判斷骨肉瘤惡性程度的一個指標。

骨肉瘤；CD44s；CD44v6；CD44v9

骨肉瘤在所有原發于骨組織的惡性腫瘤中所占比例最高〔1〕，盡管手術加化療已使非轉移性骨肉瘤患者5年生存率由20%提升到60%〔2，3〕，但骨肉瘤極易發生轉移，大約20%的患者在骨肉瘤確診時已經出現了轉移灶，另外80%的患者在手術治療后發生了轉移〔4，5〕。這些伴有轉移的骨肉瘤患者，其5年生存率仍舊為20%〔6〕。CD44在骨肉瘤浸潤和轉移中發揮著重要作用〔7〕。CD44屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白家族，負責調控細胞與細胞及ECM間的相互作用〔8〕。CD44基因經選擇性剪切和轉錄后修飾形成了多種CD44v，它們是CD44參與調控淋巴細胞激活、再循環及歸巢、炎癥反應和腫瘤轉移等生物學功能的基礎〔9〕，其中CD44s、v6和v9的反常表達與腫瘤的侵襲、轉移及預后關系密切〔10～13〕。本實驗擬探討變異體CD44s、CD44v6及CD44v9與骨肉瘤分化、轉移及惡性程度的關系。

1 材料與方法

1.1 對象 收集吉林大學第二醫院2009年4月至2013年1月的骨腫瘤病理切片，由兩名病理科醫生獨立診斷，同時結合臨床資料確定腫瘤的轉移情況。共收集到23例患者，其中骨肉瘤10例，男7例，女3例；年齡12～87歲，低分化6例、高分化4例，發生轉移6例、無轉移4例；骨巨細胞瘤8例，男女各4例，年齡26～54歲；骨軟骨瘤5例，男3例，女2例；年齡9～73歲。患者臨床資料完整，且術前未進行放、化療。

1.2 主要試劑 Trizol購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒“PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA ynthesis Kit”購自Takara公司，瓊脂糖購自BIOWEST公司，TAE電泳液(50×)購自天恩澤公司，qPCR試劑盒“All-in-OneTMqPCR Mix”購自GeneCopoeia公司，定量PCR反應板購自BIOPLASTICS公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成 CD44s、CD44v6及CD44v9引物序列參考文獻〔14〕，序列：CD44s上游引物5′-GGAGCAGCACTTCAGGAGGTTAC-3′，下游引物5′-GGAATGTGTCTTGGTCTCTGGTAGC-3′；CD44v6上游引物5′-CCAGGCAACTCCTAGTAGTACAACG-3′，下游引物5′-CGAATGGGAGTCTTCTTTGGGT-3′；CD44v9上游引物5′-AGCAGAGTAATTCTCAGAGC-3′，下游引物5′-TGATGTCAGAGTAGAAGTTGTT-3′；β-actin上游引物5′-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3′，下游引物5′-GAAGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′。引物由上海賽百盛公司合成。

1.3.2 標本組織切片RNA提取 標本組織RNA提取方法參照文獻〔15〕。主要步驟：①取切片3張，浸于二甲苯5 min，無水乙醇洗滌兩遍，自然晾干；②在切片上滴加組織裂解緩沖液(20 mmol/L Tris，pH8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；2% SDS，pH7.2)，將切片上組織刮入1.5 ml離心管內，加組織裂解緩沖液250 μl混勻，加入蛋白酶K(終濃度400 mg/L)，置于58℃消化至液體清亮，消化后的組織置于 95℃10 min。③加Trizol 1 ml，按Trizol試劑說明書進行RNA 提取。將提取到的RNA進行含量、純度及完整性檢測，-80℃保存備用。

1.3.3 標本RNA逆轉錄 取標本RNA 3 μl，按照逆轉錄試劑盒說明書將各標本RNA逆轉錄為cDNA，-20℃保存備用。

1.3.4 實時熒光定量PCR 每孔反應體系共計20 μl，包括標本cDNA 1 μl，“2×All-in-one qPCR Mix”10 μl，上下游引物各0.5 μl，“50×RoxReference Dye”0.4 μl，去RNase水7.6 μl。反應條件為95℃ 3 min初變性，然后95℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，共計40個循環，隨后72℃延伸3 min。應用IDEAS軟件計算出CT值，應用2-△△CT方法計算各基因在標本中表達的相對定量。

1.4 統計分析 應用SPSS19軟件行方差分析和獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1 CD44s在各組標本中的表達 CD44s在骨肉瘤組和骨巨細胞瘤組的相對表達量高于骨軟骨瘤組(P<0.05)，而在骨肉瘤組和骨巨細胞瘤組表達無顯著差異(P>0.05)。

2.2 CD44v6在各組標本中的表達 CD44v6在骨肉瘤組和骨巨細胞瘤組表達量高于骨軟骨瘤組(均P<0.05)，而在骨肉瘤組和骨巨細胞瘤組無顯著差異(P>0.05)。

2.3 CD44v9在各組標本中的表達 CD44v9在骨軟骨瘤組無表達，而在骨肉瘤組和骨巨細胞瘤組的表達量無顯著差異(P>0.05)。

2.4 CD44s、CD44v6和CD44v9的表達與骨肉瘤分化的相關性 CD44v9在低分化骨肉瘤表達的相對定量高于高分化骨肉瘤(P<0.05)，而CD44s、CD44v6無類似相關性，見表1。

2.5 CD44s、CD44v6和CD44v9在骨肉瘤標本中的表達與轉移的相關性 CD44v9在轉移性骨肉瘤表達量高于非轉移性骨肉瘤(P<0.05)，而CD44s、CD44v6無類似相關性，見表2。

表1 CD44s、CD44v6和CD44v9在骨肉瘤低分化組和高分化組的表達±s)

與低分化組相比：1)P<0.05

表2 CD44s、CD44v6和CD44v9在骨肉瘤轉移組和非轉移組的表達±s)

與轉移組比較：1)P<0.05

3 討 論

CD44s是CD44變異體標準型。彭挺生等〔16〕的研究表明相比骨纖維結構不良標本，CD44s在骨肉瘤中的表達水平顯著升高，CD44s的表達與骨肉瘤的分化呈負相關，并且其表達水平越高越容易出現肺部轉移。筆者同樣分析了CD44s表達與骨肉瘤分化和轉移的相關性，但未發現類似相關性。Kim等〔17〕應用免疫組化檢測50例骨肉瘤標本中CD44s、CD44v5、CD44v6的表達水平，結果未發現CD44s的表達與分化和轉移有明顯相關性，與本的研究結果相似。

CD44v6是研究較早的一種CD44v。陳雷等〔18〕應用免疫組化研究結果證實，相較骨軟骨瘤及正常骨組織，CD44v6 在骨肉瘤中的表達顯著升高，但與預后無顯著相關性，CD44v6可作為判斷骨肉瘤惡性程度的指標。林建華等〔19〕采用免疫組化實驗，結果表明相較骨軟骨瘤和正常骨組織，MMP-9及CD44v6在骨肉瘤的表達水平明顯升高，兩者表達呈正相關，作者認為通過聯合檢測患者病理標本中MMP-9及CD44v6的表達可以判斷骨肉瘤的惡性程度。辛榕等〔20〕研究表明相比骨軟骨瘤，CD44、CD44v3和v6在骨肉瘤的表達顯著升高，并且CD44v6的表達水平最高，CD44V6可以作為診斷骨腫瘤惡性表型的標志。筆者實驗同樣證實相比骨軟骨瘤，CD44v6在骨肉瘤和骨巨細胞瘤的表達水平顯著升高，但未發現CD44v6的表達與骨肉瘤分化和轉移有明顯相關性，因此CD44v6不能作為骨肉瘤惡性程度的標志。

有關CD44v9與骨肉瘤關系的研究較少。高文〔21〕采用免疫組化發現CD44v9在骨肉瘤的表達水平高于另外兩者，并且在骨軟骨瘤中陽性表達率為0。本實驗同樣證實CD44v9在骨肉瘤的表達高于骨軟骨瘤且CD44v9在骨軟骨瘤中無表達，但未能證明CD44v9在骨肉瘤的表達高于骨巨細胞瘤。另外筆者發現CD44v9的表達與骨肉瘤分化和轉移有關張翠萍等〔22〕應用RT-PCR技術檢測CD44v9在結直腸癌組織中的表達，發現CD44v9與結直腸癌的轉移性有關。李志高等〔23〕應用免疫組化技術檢測發現CD44v9的表達與大腸癌分化和轉移有關：CD44v9表達隨大腸癌分化程度降低而升高，在伴有轉移的大腸癌中表達高于非轉移大腸癌中的表達。以上兩次研究均證實CD44v9可以成為判斷腫瘤惡性程度的重要生物學標志，與本實驗結論相似。

綜上所述，CD44s、CD44v6及CD44v9在不同骨腫瘤之間表達有差異。CD44s、CD44v6及CD44v9三者當中只有CD44v9的表達與骨肉瘤的分化和轉移有相關性，并且分化和轉移關系密切。CD44v9可作為判斷骨肉瘤惡性程度的一個指標。

1 Savage SA，Mirabello L.Using epidemiology and genomics to understand osteosarcoma etiology〔J〕.Sarcoma，2011；2011：548151.

2 Jaffe N，Carrasco H，Raymond K，etal.Can cure in patients with osteosarcoma be achieved exclusively with chemotherapy and abrogation of surgery〔J〕? Cancer，2002；95(10)：2202-10.

3 Meyers PA，Schwartz CL，Krailo M,etal.Osteosarcoma：a randomized，prospective trial of the addition of ifosfamide and/or muramyl tripeptide to cisplatin，doxorubicin，and high-dose methotrexate〔J〕.J Clin Oncol,2005；23(9)：2004-11.

4 Link MP，Goorin AM，Miser AW，etal.The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity〔J〕.N Engl J Med,1986;314：1600-6.

5 Marina N，Gebhardt M，Teot L，etal.Biology and therapeutic advances for pediatric osteosarcoma〔J〕.Oncologist,2004;9：422-41.

6 Longhi A，Errani C，De Paolis M，etal.Primary bone osteosarcoma in the pediatric age：state of the art〔J〕.Cancer Treat Rev,2006；32：423-36.

7 Naor D，Nedvetzki S，Golan I，etal.CD44 in cancer〔J〕.Crit Rev Clin Lab Sci,2002；39：527-79.

8 Aruffo A，Stamenkovic I，Melnick M，etal.CD44 is the principal cell surface receptor for hyaluronate〔J〕.Cell,1990;61(7)：1303-13.

9 Ponta H，Sherman L，Herrlich PA.CD44：from adhesion molecules to signalling regulators〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2003；4：33-45.

10 Zhang XG，Lu XF，Jiao XM，etal.PLK1 gene suppresses cell invasion of undifferentiated thyroid carcinoma through the inhibition of CD44v6，MMP-2 and MMP-9〔J〕.Exp Ther Med，2012;4(6):1005-9.

11 Zhou ZJ，Dai Z，Zhou SL,etal.Overexpression of HnRNP A1 promotes tumor invasion through regulating CD44v6 and indicates poor prognosis for hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Cancer，2013;132(5):1080-9.

12 Kuryu M，Ozaki T，Nishida K，etal.Expression of CD44 variants in osteosarcoma〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,1999；125：646-52.

13 陳 啟，魏法才，張愛霞，等.轉移相關基因CD44V9在乳腺癌中的表達及其臨床意義〔J〕.中國普通外科雜志，2006；15(4)：295-7.

14 Li Z，Chen K，Jiang P，etal.CD44v/CD44s expression patterns are associated with the survival of pancreatic carcinoma patients〔J〕.Diag Pathol,2014；9：79.

15 孟 青，楊文秀，胡 軍，等.石蠟包埋組織中RNA提取方法的改進和完善〔J〕.貴陽醫學院學報，2005；30(3)：241-3.

16 彭挺生，邱鉅世，李 陽，等.CD44s、MMP-9、Ki-67的表達與骨肉瘤侵襲、轉移、復發的關系〔J〕.癌癥，2002；21(7)：745-50.

17 Kim HS，Park YB，Oh JH，etal.Expression of CD44 isoforms correlates with the metastatic potential of osteosarcoma〔J〕.Clin Orthop Relat Res，2002；396(396):184-90.

18 陳 雷，林建華，張 聲.CD44v6在骨肉瘤的表達與臨床意義〔J〕.福建醫科大學學報，2001；35(1)：24-5.

19 林建華，陳 雷，張 聲.MMP-9、CD44v6在骨肉瘤中的表達及其臨床意義〔J〕.中國骨腫瘤骨病，2002；1(1)：35-7.

20 辛 榕，郭喬楠，馮俊明.粘附分子CD44、CD44V3、CD44V6及PCNA在人骨肉瘤中的表達及其臨床意義〔J〕.第三軍醫大學學報，2003；25(10)：874-6.

21 高 文.CD44v9在骨肉瘤、骨巨細胞瘤、骨軟骨瘤中的表達〔D〕.沈陽：中國醫科大學，2005.

22 張翠萍，張 琪，武 軍,等.CD44v9和MMP-9在結直腸癌組織中表達的臨床意義〔J〕.中華胃腸外科雜志，2005；8(2)：179-80.

23 李志高，李曉東，董新舒，等.大腸癌組織RAB5A和CD44v9表達的意義〔J〕.世界華人消化雜志，2006；14(9)：845-52.

〔2016-07-20修回〕

(編輯 曲 莉)

王亞軍(1960-)，男，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事骨與關節、 四肢創傷臨床研究。

王志濤(1989-)，男，在讀碩士，主要從事骨與關節、 四肢創傷臨床研究。

R68

A

1005-9202(2016)20-4998-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.024