腫瘤壞死因子-α基因多態性及其血清水平與腦梗死的相關性

劉 丹 張 偉 孫洪英 董向力 王貴喜 賈 璐 李新輝 張 佳 楊 靜

(包頭醫學院第一附屬醫院神經內科，內蒙古 包頭 014010)

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·心、腦血管及代謝性疾病·

腫瘤壞死因子-α基因多態性及其血清水平與腦梗死的相關性

劉 丹 張 偉 孫洪英 董向力 王貴喜 賈 璐 李新輝 張 佳 楊 靜

(包頭醫學院第一附屬醫院神經內科，內蒙古 包頭 014010)

目的 探討腫瘤壞死因子(TNF)-α T1031C多態性位點及血清水平與動脈粥樣硬化性腦梗死的病情嚴重程度和發病風險的關系。方法 選擇動脈粥樣硬化性腦梗死患者(病例組)120例，健康者75例為對照組。采用限制性片段長度多態性分析技術，檢測兩組TNF-α T1031C多態的分布。采用酶聯免疫吸附法(ELLSA)檢測兩組患者血清TNF-α水平。結果 病例組TNF-α T1031C的CC基因型、C等位基因頻率明顯高于對照組(P<0.05)。TNF-α T1031C的各基因型與腦梗死病情嚴重程度無相關性(P>0.05)。Logistic回歸校正性別、年齡、吸煙、血糖、血壓等因素后，TNF-α T1031C的CC基因型腦梗死發病風險明顯增加(OR=3.671，95%CI：10.26～13.135，P=0.046)。病例組TNF-α血清水平明顯高于對照組(P<0.05)。病例組和對照組TNF-α T1031C各基因型的血清TNF-α水平無顯著差異(P>0.05)。結論 TNF-α基因 T1031C的CC基因型增加動脈粥樣硬化性腦梗死的發病風險，C等位基因是腦梗死的遺傳易感基因之一。

腫瘤壞死因子α；基因多態性；腦梗死；遺傳易感性

動脈粥樣硬化性腦梗死的病因復雜，遺傳和環境因素在其發病過程中起重要的作用，其發病機制至今尚未完全明確，但目前認為腦缺血缺氧造成的能量代謝障礙、興奮性神經介質釋放、鈣過量內流、自由基反應、細胞凋亡、炎癥免疫反應等一系列缺血性連鎖反應是導致缺血性腦損害的中心環節〔1〕。腫瘤細胞壞死因子(TNF)-α作為最重要的免疫和炎癥相關因子之一，廣泛參與體內各種炎癥和免疫應答過程。研究表明，血清TNF-α水平在腦梗死急性期增高，與腦梗死的發病、發生發展密切相關〔2～5〕。TNF-α基因多處位點存在多態性，有報道其基因多態性與冠心病、腦梗死等動脈粥樣硬化性疾病和免疫疾病密切相關〔6～11〕，但TNF-α 基因T1031C多態性與腦梗死的相關研究未見報道。本文研究探討TNF-α基因T1031C多態性、血清TNF-α水平與動脈粥樣硬化性腦梗死的病情嚴重程度和發病風險的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2012年9月至2013年6月在我科連續住院的初發動脈粥樣硬化性腦梗死(發病1 w之內)患者(病例組)120例，男73例，女47例，平均年齡(62.43±11.72)歲，不包括腔隙性腦梗死和腦栓塞患者，均符合全國第四屆腦血管病學術會議通過的診斷標準，并經頭顱CT或MRI檢查證實。排除標準：嚴重感染、惡性腫瘤、結締組織病以及1年內患組織損傷疾病如心肌梗死，重大外科手術及接受免疫抑制劑治療者除外。同期選擇健康體檢者為對照組75例，男45例，女30例，平均年齡(61.69±9.68)歲。兩組年齡(t=0.453，P=0.651)、性別(χ2=0.013,P=0.908)相比無統計學差異。所有入組者均知情同意，均為包頭市長住居民、漢族、彼此無親緣關系。

1.2 方法

1.2.1 血液標本收集與測定 病例組患者在入院第2天清晨06：00空腹采集靜脈血4 ml和2 ml各1管，4 ml管離心后取血清，放于-30℃低溫冰箱中保存待測TNF-α血清濃度，2 ml管置EDTA-Na2抗凝管中-30℃冰箱保存檢測基因多態性。TNF-α血清水平檢測方法采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，試劑盒是美國R&D公司分裝。操作過程按試劑盒說明。TNF-α基因 T1031C多態性采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測。對照組在體檢當天亦空腹采血，保存和檢測方法同上。

1.2.2 病例登記 對病例組患者和對照組進行登記。登記內容包括：①患者的一般資料(包括姓名、性別、年齡、職業、民族、住院號、地址、聯系電話等)；②既往情況(既往病史及健康狀況、吸煙飲酒史)；③住院情況〔包括入院日期、入院美國國立衛生院神經功能缺損評分(NIHSS)評分、實驗室血液學檢驗值、頸部血管超聲、頭顱影像結果、出院日期、并發癥等〕。

1.3 基因型判定 采用PCR檢測，PCR引物序列參照文獻設計，由上海生工合成。TNF-α T1031C基因擴增引物序列為：上游引物：5'-TATGTGATGGACTCACCAGGT-3'，下游引物：5'-CCTCTACATGGCCCTGTCTT-3'，擴增產物為264 bp。反應體系為25 μl，其中模板DNA模板5 μl，PremixEx Taq DNA 聚合酶12.5(含Buffer，dNTP，MgCl2)，上游及下游引物各1 μl(10 pmol/L)，加無菌蒸餾水至25 μl。循環參數：94℃預變性5 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物分別經BbsⅠ限制性內切酶37℃水浴2 h后，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后分析基因型。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件行方差分析及χ2檢驗，采用Logistic回歸分析基因型與腦卒中的發病關系。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料、生化指標及血清TNF-α水平比較 與對照組比較，病例組吸煙者比例、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血小板水平、血清TNF-α水平增高(P<0.05)，總膽固醇(TC)水平雖增高，但差異未達到統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較±s)

2.2 兩組TNF-α基因型鑒定 兩組TNF-α T1031C基因型，分別為TT、TC、CC型，均以TT型為主，CC型最少。TNF-α T1031C的CC基因型(純和突變型)為195 bp和69 bp兩條片段，TC基因型(雜合型)為264 bp，195 bp和69 bp 3條片段，TT基因型(野生型)為440 bp 1條片段(圖1)。

M:50 bp DNA ladder；1、2、3、5、7、8：TT型；4、6：TC型；10：CC型圖1 PCR-BbsⅠ酶切的TNF-α 1031SNP基因型分型

2.3 兩組TNF-α T1031C基因型和等位基因頻數分布比較 兩組人群TNF-α T1031C多態性基因型分布均處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。與對照組比較，病例組CC基因型和C等位基因頻率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 病例組與對照組TNF-α T1031C基因型和等位基因頻率〔n(%)〕

與對照組比較：1)P<0.05

2.4 TNF-α T1031C基因型與腦梗死病情嚴重程度的相關性 病例組根據NIHSS標準在入院第1天進行評分，分為輕型組(<4分)71例，中型組(4～10分)27例，重型組(>10分)22例。未發現TNF-α T1031C基因型與腦梗死病情嚴重程度存在相關性(χ2=7.486,P=0.112)，見表3。

表3 TNF-α T1031C基因型與腦梗死病情嚴重程度相關性〔n(%)〕

2.5 TNF-α T1031C不同基因型與腦梗死發病風險的關系 以腦梗死是否發生為因變量，以年齡、性別、吸煙史、FPG、DBP、SBP、TC、TG、LDL-C、HDL-C和TNF-α T1031C基因型為自變量，進行多因素Logistic回歸分析結果表明，TNF-α T1031C的CC基因型(OR=3.671，95%CI：10.26～13.135，P=0.046)、TC水平、LDL-C、FPG、SBP、TG顯著增加腦梗死的發病風險(P<0.05)，是腦梗死發生的獨立危險因素。

2.6 TNF-α T1031C基因型與TNF-α血清水平的相關性 兩組TNF-α T1031C各基因型的血清TNF-α水平無顯著差異(P>0.05)，見表4。

表4 不同TNF-α基因型患者TNF-α血清水平

3 討 論

TNF-α是一種重要的具有廣泛生物學功能的多肽類細胞因子，主要是由激活的單核C巨噬細胞分泌產生的細胞因子〔12〕，TNF-α在活化的巨噬細胞內以膜結合型存在，并多以旁分泌或自分泌釋放。在正常情況下，它具有抗腫瘤、抗感染和促進組織修復等作用，對機體有利。若持續釋放，則會引起機體發熱、休克、惡病質和組織損傷。因此它不僅是一種重要的免疫細胞因子，又是一種重要的炎性細胞因子〔13〕。近年研究表明，TNF-α與腦梗死、動脈粥樣硬化、冠心病、免疫相關等疾病密切相關〔2～5〕，參與了這些疾病的發生發展。

人類TNF-α基因定位于人染色體6p21.1-p21.3，位于MHC Ⅲ類基因區內。TNF-α基因具有多態性，其多態性位點主要集中在其啟動子區域的：-1031、-244、-308、-376、-49、-419、-163、-238、-857、-863等位點。目前關于其-308、-238 位點的多態性與疾病的研究較多，有報道TNF-α G308A及TNF-α G238A 多態性與動脈粥樣硬化、腦梗死、冠心病的發生有關聯〔6～9，14〕。

本研究結果提示，TNF-α基因T1031C多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳易感性相關，C等位基因是動脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳易感基因之一。推測，TNF-α基因的1031位點的堿基T被堿基C所替代，可能影響TNF-α的表達，從而促進腦梗死的發生發展。同時本研究首次對TNF-α基因 T1031C多態性與腦梗死病情嚴重程度進行分析后發現，TNF-α基因 T1031C多態性與腦梗死病情嚴重程度無相關性，也提示TNF-α基因 T1031C多態性可能對于內蒙古地區漢族人群的腦梗死病變程度沒有影響。

本研究結果與曹紅元等〔2～4〕研究結果一致，表明不論是病例組還是對照組，TNF-α T1031C各基因型的血清TNF-α水平無顯著差異，這說明二者之間無相關性。

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〔2015-03-09修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢園)

內蒙古自治區高等學校科學技術研究一般項目(No.NJZY13245)；包頭市社會發展科技支撐項目(2012S2006-04-08)

劉 丹(1973-)，女，碩士，主任醫師，教授，碩士生導師，主要從事腦血管病基礎與臨床研究。

R743.3

A

1005-9202(2016)20-5002-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.026