白藜蘆醇對凍融后小鼠成熟卵母細胞氧化應激水平和線粒體功能的影響

莊少虹　黃寶怡　曾艷婷　劉曼婷　徐佳慧　劉見橋廣州醫科大學附屬第三醫院廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室，廣東廣州　510150

白藜蘆醇對凍融后小鼠成熟卵母細胞氧化應激水平和線粒體功能的影響

莊少虹黃寶怡曾艷婷劉曼婷徐佳慧劉見橋
廣州醫科大學附屬第三醫院廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室，廣東廣州510150

目的 探討白藜蘆醇（Res）對凍融后小鼠成熟卵母細胞活性氧（ROS）水平和線粒體功能的影響。方法 根據是否在冷凍復蘇培養液中添加Res，將解凍后存活的卵母細胞分為兩組：Res組和對照組。二氯熒光素二乙酸（DCFH-DA）檢測ROS水平，JC-1熒光染色檢測線粒體膜電位（ΔΨm）。結果 卵母細胞玻璃化冷凍解凍的存活率為89.0%（267/300），其中125、142枚分別進行ROS和ΔΨm檢測。Res組的ROS水平 （0.64±0.17）較對照組（1.00±0.26）明顯降低（P＜0.01），Res組的ΔΨm（1.16±0.40）較對照組（0.87±0.28）明顯增加（P＜0.01）。結論 Res能降低小鼠凍融卵母細胞的氧化應激水平并增加其線粒體功能，可能有助于卵母細胞的損傷修復。

白藜蘆醇；卵母細胞；玻璃化冷凍；活性氧；線粒體膜電位

近年來，人類卵母細胞的冷凍保存在輔助生殖領域中扮演著重要角色。特別是隨著玻璃化冷凍技術的發展，卵子冷凍技術已經逐漸從“實驗”階段向“臨床”使用階段邁進。但由于卵母細胞是人體內最大的細胞，有其特殊的生物學特性，其相對于胚胎和精子更容易受到冷凍損傷。有研究指出，冷凍會造成卵母細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增加[1]，已有證據表明，ROS的增加會進一步影響卵母細胞內的紡錘體等結構，并造成卵子受精失敗和胚胎發育障礙[1-3]。另有學者報道，進行玻璃化冷凍的卵母細胞，其線粒體膜電位會顯著降低[4-5]。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是近年研究熱度僅次于紫杉醇的藥物，具有抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等作用[6-8]，其對冷凍復蘇的卵母細胞是否有保護作用仍罕有報道，因此，本研究通過在凍融卵母細胞的復蘇培養液中添加Res，試圖減輕凍融對卵母細胞造成的不良影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

7～9周齡的SPF級雌性ICR小鼠（購自廣東省實驗動物中心）；孕馬血清促性素（PMSG）（寧波第二激素廠）；絨促性素（HCG）（上海麗珠制藥）；白藜蘆醇（Sigma公司）；M2培養液（Sigma公司）；透明質酸酶（Vitrolife Sweden AB Goteborg，Sweden）；DEFH-DA（Sigma公司）；JC-1試劑盒（Sigma）；玻璃化冷凍解凍試劑盒（Kitazato Biophama Co.Ltd.Shizuoka.Japan）。冷凍試劑盒包括平衡液（ES）和冷凍液（VS），解凍試劑盒包括WS1、WS2、WS3及WS4。

儀器：共聚焦顯微鏡（Nikon-C2Si）。

1.2卵母細胞的收集

ICR雌鼠腹腔注射PMSG 10 U/只，46～48 h后注射HCG，10 U/只，13～15 h后處死，并立即于輸卵管壺腹部收集卵丘-卵母細胞復合體，隨后用10%透明質酸酶脫去顆粒細胞，得到成熟的MⅡ期卵母細胞。

1.3卵子冷凍解凍方法與實驗分組

冷凍：將3～4枚卵母細胞置于20μL的ES液滴中，停留5 min，然后將卵子轉移到另一個20μL的VS液滴中，停留約40 s后立即裝載至開放式冷凍載體上，并迅速置于液氮中，從開始暴露于VS到置于液氮中的時間不超過1 min。解凍：從液氮中取出裝有卵子的冷凍載體，迅速置于37℃預熱的WS1液中，停留1 min，隨后將卵母細胞依次轉移至室溫平衡過的WS2、WS3、WS4中，各停留3 min后判斷卵母細胞是否存活。隨后將那些透明帶和細胞膜完整、胞質透亮的存活卵母細胞置于含或不含Res的M2培養液中繼續培養3 h，即依據是否在冷凍復蘇培養液中添加Res分為對照組和Res組。Res在培養液中的濃度為25μmol/L。

1.4ROS水平的檢測

二氯熒光素二乙酸（DCFH-DA）是檢測ROS的常用試劑，本身沒有熒光，但其可以自由穿過細胞并被細胞內的ROS氧化生成DCFH，而生成的DCFH能發出熒光卻不能透過細胞膜，因此，DCFH逐漸在細胞內積累并能被激光共聚焦顯微鏡觀察到。熒光強度越強，說明細胞內的ROS水平越高。檢測時，將對照組和Res組的卵母細胞同時置于預熱過的10 mmol/L的工作液中，避光并在37℃、5%CO2培養箱中孵育20 min，洗滌3～5次后立即用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.5線粒體膜電位（ΔΨm）的檢測

JC-1是目前使用最廣泛的ΔΨm檢測熒光探針。當ΔΨm＜100 mV時，JC-1為單體形式，產生綠色熒光，但當ΔΨm＞140 mV時，JC-1聚集形成聚合物，產生紅色熒光。因此，通過紅綠熒光強度的相對比值便可準確地判斷卵母細胞ΔΨm，其比值越高，表明卵母細胞ΔΨm越高，即線粒體的功能越活躍。檢測時，將200×的JC-1濃儲存液用超純水及緩沖液稀釋成1×的染色工作液，并配成微滴置于37℃培養箱預熱。隨后，將要檢測的卵母細胞置于微滴中，37℃、5%CO2培養箱中孵育20 min。使用4℃預冷的緩沖液洗滌3～5次后，立即用激光共聚焦顯微鏡觀察保存，并用Image J軟件進行定量分析。

1.6統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（）表示，采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1玻璃化解凍復蘇存活率

共冷凍解凍300枚成熟的MⅡ卵母細胞，其中有267枚存活，總的存活率為89.0%，形態正常且存活卵母細胞被分配到對照組和Res組中，進行線粒體膜電位和ROS水平的檢測。

2.2對照組和Res組ROS熒光圖像及其相對熒光強度比較

共納入125枚存活的MⅡ卵母細胞，對照組和Res組分別為63枚和62枚。從圖1可以看出，對照組的綠色熒光相對較強，而Res組的熒光強度較對照組明顯減弱；Res組和對照組的相對熒光強度分別為0.64±0.17和1.00±0.26，差異有高度統計學意義（P=0.000），說明在復蘇培養中添加Res能顯著降低凍融卵母細胞的ROS水平。

圖1　對照組和Res組ROS熒光圖像及其相對熒光強度比較

2.3對照組和Res組線粒體膜電位熒光圖像及其紅/綠熒光強度比值比較

共有142枚凍融后存活的卵母細胞進行該項檢測，對照組和Res組分別為72枚和70枚。從圖2可以看出，對照組和Res組的紅色熒光均主要分布于卵母細胞的外周，綠色熒光分布于整個胞漿；Res組和對照組的紅/綠熒光強度比值分別為 1.16±0.40和0.87±0.28，差異有高度統計學意義（P=0.000），說明在復蘇培養液中添加Res后，凍融卵母細胞的ΔΨm明顯增加。

圖2　對照組和Res組線粒體膜電位熒光圖像及其紅/綠熒光強度比值比較

3　討論

卵母細胞的冷凍保存作為女性生育力保存的重要方法，在輔助生殖領域中具有不可替代的作用。早在1986年，Chen等就使用人冷凍復蘇卵子并首次獲得成功妊娠，但其后20余年，該項技術發展緩慢，而近幾年發展起來的玻璃化冷凍技術使卵母細胞冷凍的存活率相比過去的程序化冷凍大大增加，但其胚胎發育潛能仍明顯比新鮮卵母細胞差[9-12]。胚胎學家們一直嘗試各種方法，如改善冷凍方法和改良冷凍液配方來減少冷凍損傷，但其效果仍不理想[13]。Res是廣泛存在于花生、紫葡萄、紅酒、虎杖、桑椹等植物中的一種多酚類化合物，已有大量研究證實，其具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老等作用[6-8]，本文首次嘗試在小鼠冷凍復蘇培養液中添加Res，發現其能減少凍融后卵母細胞ROS的生成，并增加線粒體的活力。

細胞氧化磷酸化過程中產生的過量ROS會導致氧化應激，即氧化和抗氧化失衡，其會產生一系列的病理過程并最終導致細胞老化和凋亡[14]。已有研究證實，冷凍會造成卵母細胞中ROS的異常增加[1]，而ROS的增加會損傷卵母細胞中的紡錘體和細胞骨架，并進一步對卵母細胞的正常受精和胚胎發育產生不利影響[1，3]。本研究證實，Res能顯著減少凍融后卵母細胞中ROS的產生，這將提高卵母細胞的質量，并減少凍融卵母細胞的受精失敗率和胚胎阻滯率。

線粒體作為胞質中最重要的細胞器，對卵母細胞成熟和胚胎發育具有重要的作用[15-16]。冷凍過程中因滲透壓改變，劇烈的溫度、pH變化、冰晶形成等因素造成的線粒體損傷會導致ΔΨm下降[4-5]，而ΔΨm是氧化磷酸化過程生成ATP能力的反映。也就是說，當卵母細胞的ΔΨm較低時，則說明其生成ATP的能力下降，卵母細胞的進一步受精和胚胎發育也將因為供能不足而受到影響[17-18]。本研究通過在凍融卵母細胞的復蘇培養液中添加Res，明顯增加了線粒體膜電位，提高了線粒體的活力，這將會增加卵母細胞ATP的產生，并促進其進一步受精和發育。

以往研究報道，Res的使用劑量因實驗條件和實驗對象的改變而有所不同[19-21]。Liu等[19]在卵母細胞的體外成熟過程中添加Res來對抗丙酮醛引起的氧化應激反應，研究探討了5、10、25μmol/L三個作用濃度對卵母細胞ROS水平和線粒體分布等因素的影響，結果顯示，隨著Res作用濃度的增加，卵母細胞內的ROS水平逐漸下降，線粒體異常分布的比例也逐漸下降，即25μmol/L的Res能顯著改善卵母細胞的ROS水平和線粒體分布。另外，有研究證實，在胚胎培養液中添加過高濃度的Res會降低胚胎的發育潛能[14]；Price等[22]發現，在小鼠C2C12細胞中，25μmol/L的Res會增加線粒體ΔΨm和ATP的產生，而50μmol/L的Res的作用則相反。具體原因仍不清楚，但可能與Res的溶解劑二甲基亞砜（DMSO）有關。Res不溶于水，必須使用DMSO等物質進行溶解，而DMSO本身對細胞和胚胎具有毒性作用[23-24]。因此，本研究選擇25μmol/L的Res作為最終的作用濃度，結果顯示，該濃度的Res能顯著降低凍融后卵母細胞的ROS水平并增加線粒體的ΔΨm，但該濃度是否為最佳的使用濃度仍需進一步探討。

Res減少卵母細胞 ROS產生和增加 ΔΨm的具體機制仍不清楚，有研究指出，這可能與其能活化Sirt1/AMPK和Nrf2通路有關[7]，但仍需進一步研究證實。總之，本研究表明，Res作為一種強的抗氧化劑，能有效降低小鼠凍融卵母細胞內的ROS水平并改善線粒體功能，對冷凍造成的卵母細胞損傷具有修復作用。

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Influence of resveratrol on oxidative stress level and m itochondrial function of vitrified-thawed mature oocytes in m ice

ZHUANG ShaohongHUANG Baoyi ZENG YantingLIU MantingXU Jiahui LIU Jianqiao
Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes,the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou510150,China

Objective To explore influence of resveratrol(Res)on reactive oxygen species(ROS)level and mitochondrial function of vitrified-thawed mature oocytes in mice.M ethods According to whether add Res to the post-warming culture medium or not,survived oocytes after thawing were divided into two groups:Res group and control group.The level of ROS was measured by DCFH-DA,while the mitochondrial membrane potential(ΔΨm)was detected by JC-1 fluorescence staining.Results The survive rate of oocytes vitrification was 89.0%(267/300),and 125 of the survive oocytes were detected by ROS while 142 of them were detected byΔΨm.ROS level in Res group(0.64±0.17)was significantly lower than that in control group(1.00±0.26)(P＜0.01).ΔΨm of Res group(1.16±0.40)was significantly higher than that of control group(0.87±0.28)(P＜0.01).Conclusion Res reduces oxidative stress level and improves mitochondrial function of vitrified-thawed mature oocytes in mice.It may contribute to the repair of cryodamage in vitrified-thawed oocytes.

Resveratrol;Oocyte;Vitrification;Reactive oxygen species;Mitochondrial membrane potential

R-332

A

1673-7210（2016）04（b）-0027-04

莊少虹（1989.4-），女，廣州醫科大學婦產科專業2013級在讀碩士研究生；研究方向：生殖內分泌。

劉見橋（1970.5-），男，博士，主任醫師，廣州醫科大學附屬第三醫院生殖中心主任；研究方向：生殖內分泌。

（2016-01-03本文編輯：李亞聰）