GOLPH3、VEGF在胃癌組織中的表達及其相互關系

產世鑫，孟翔凌，吳文涌

?

GOLPH3、VEGF在胃癌組織中的表達及其相互關系

產世鑫，孟翔凌，吳文涌

目的 通過檢測胃癌組織中高爾基體磷酸化蛋白3(GOLPH3)與血管內皮生長因子(VEGF)表達水平，探討二者在胃癌進展中的相互關系。方法 通過免疫組織化學SP法檢測55例經手術切除的胃癌組織及相應癌旁組織中GOLPH3和VEGF蛋白的表達情況。GOLPH3與VEGF在胃癌組織中表達相關性采用Pearson相關性分析。結果 GOLPH3及VEGF在胃癌組織中的陽性表達率分別為67.27%、58.18%，顯著高于相應癌旁組織的18.18%、23.64%，差異有統計學意義(P<0.05)。GOLPH3、VEGF在胃癌組織中的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小等均無顯著相關性，與浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期有顯著相關性(P<0.05)。免疫組織化學結果顯示在GOLPH3陽性表達組的胃癌組織中，VEGF陽性表達率為75.68%，明顯高于GOLPH3陰性表達組的22.22%，胃癌組織中GOLPH3表達與VEGF的表達呈正相關性(r=0.508，P<0.01)。結論 GOLPH3過表達可能通過上調VEGF的表達調節胃癌血管生成，從而影響胃癌的浸潤和轉移。

胃癌；高爾基體磷酸化蛋白3； 血管內皮生長因子；血管生成

胃癌嚴重危害著人類健康和生命，其發病率占全球惡性腫瘤的第4位，因胃癌導致的腫瘤相關死亡率僅次于肺癌，在世界上排第2位[1]。盡管胃癌的手術治療、化學治療、放射治療以及相關靶向治療近些年取得了巨大進展，但是胃癌患者的預后仍然較差，這可能與胃癌的早期癥狀不明顯、患者的就診率低、缺乏有效便利的普查篩選手段，從而導致胃癌患者發現時大部分即為進展期有很大的關系。因此提高胃癌的早期診斷率、明確胃癌的發生發展機制以及采取相應的治療措施對胃癌患者的診治有著重要意義。高爾基體磷酸化蛋白3(Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3)是對高爾基體進行蛋白質組學分析時發現的，是一種從酵母到人類都高度保守的蛋白質[2]。2009年Scott et al[3]通過RNAi 基因敲除和cDNA 過表達的研究發現GOLPH3 是一個具有轉化和激活能力的癌基因。Hu et al[4]研究發現胃癌組織中GOLPH3的相對表達量與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床預后等相關。血管內皮生長因子(vasculoar endothelial growth factor，VEGF)是目前已知的腫瘤血管生成過程中特異性最強的促血管生長因子，其表達與胃癌的發展及預后密切相關[5]。然而針對GOLPH3與VEGF在胃癌組織內表達關系的研究國內外報道罕見。該研究通過免疫組織化學方法檢測胃癌組織中GOLPH3與VEGF蛋白表達情況，探討兩者在胃癌組織中表達相關性，從而為胃癌的病理診斷及治療提供理論依據和新思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料 隨機選取2012年1月～12月安徽醫科大學第一附屬醫院普通外科行胃癌根治性切除手術患者胃癌組織及相應癌旁正常組織各55例。所有患者術前均未行放化療及其他治療，術前及術后均行組織病理學檢查確診及明確臨床病理分期。男43例，女12例；年齡17～80歲(58.84±11.16)歲，其中≥60歲22例，<60歲33例；腫瘤最大直徑≥5 cm者29例，<5 cm者26例；分化程度：高、中分化共22例，低分化共33例；浸潤深度：侵犯漿膜者37例，未侵犯漿膜者18例；淋巴結轉移情況：發生淋巴結轉移39例，未發生淋巴結轉移16例；臨床病理分期根據2010年國際抗癌聯盟(UICC)和美國癌癥聯合會(AJCC)共同公布的胃癌TNM分期：其中Ⅰ/Ⅱ期患者24例，Ⅲ/Ⅳ期患者31例?；颊吲R床病理資料均完整。

1.2 主要試劑 兔抗人GOLPH3多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人VEGF單克隆抗體、生物素標記的羊抗兔IgG抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化試劑盒、二氨基聯苯(DAB)顯色劑等購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 將石蠟包埋的組織行連續切片，切片厚度4 μm。所有切片經二甲苯脫蠟，梯度濃度乙醇水化，PBS沖洗3次，每次5 min，微波法行抗原修復；3%過氧化氫溶液浸泡30 min滅活組織內源性過氧化物酶，滴加非免疫性動物血清封閉，置切片于37 ℃濕箱內孵育30 min，滴加一抗，即抗GOLPH3抗體或VEGF抗體，置于4 ℃濕箱內孵育過夜；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗覆蓋組織，37 ℃濕箱內孵育30 min；滴加新配置的DAB顯色液，顯微鏡下觀察最佳顯色時間，自來水沖洗后行蘇木精細胞核復染，0.1%鹽酸酒精浸泡3 min，自來水沖洗，PBS返藍；脫水干燥，中性樹脂封片，顯微鏡觀察結果。

1.4 染色結果判斷 雙盲情況下，由兩名病理科醫師分別對每張標本切片進行染色強度和細胞陽性率進行雙評分。細胞質或細胞核染色深度：基本不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分。每例隨機觀察5個高倍鏡(×400)視野，陽性表達細胞比例：基本不著色為0分，<10%為1分，10%～35%為2分，36%～70%為3分，>70%為4分。兩者得分相乘，>4分為陽性表達，≤4分為陰性表達。

1.5 統計學處理 應用SPSS 16.0軟件進行分析。GOLPH3及VEGF在胃癌組織及癌旁組織表達的關系、GOLPH3及VEGF與胃癌各臨床病理特征之間的關系采用χ2檢驗，胃癌組織中GOLPH3表達與VEGF表達的相關分析采用Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 胃癌組織及相應癌旁組織中GOLPH3、VEGF的表達情況 GOLPH3主要定位于細胞質，呈棕黃色顆粒(圖1A1)，在胃癌組織中陽性表達率67.27%，明顯高于癌旁組織的18.18%，差異有統計學意義(P<0.05)。VEGF主要定位于細胞質，呈棕黃色顆粒(圖1B1)，在胃癌組織中陽性表達率58.18%，明顯高于癌旁組織的23.64%，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 GOLPH3與VEGF在胃癌及癌旁組織的表達情況(n)

2.2 GOLPH3、VEGF表達分別與胃癌各臨床病理特征之間的關系 胃癌組織中GOLPH3、VEGF的表達與患者的性別、年齡和腫瘤大小無相關性，而與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期相關。GOLPH3、VEGF在高、中分化胃癌組織陽性表達率分別為78.79%、72.73%，明顯高于低分化胃癌組織的50.00%、33.33%(P<0.05)。GOLPH3、VEGF在侵犯漿膜的胃癌組織陽性表達率分別為81.08%、70.27%，明顯高于未侵犯漿膜的38.89%、33.33%(P<0.05)；GOLPH3、VEGF在有淋巴結轉移的胃癌組織陽性表達率分別為84.62%、74.36%，明顯高于無淋巴結轉移的25.00%、18.75%(P<0.01)；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期患者GOLPH3的陽性表達率分別為37.50%、90.32%(P<0.01)，VEGF在TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期患者的陽性表達率分別為25.00%、83.87%(P<0.01)。見表2。

2.3 GOLPH3與VEGF在胃癌組織中表達的相關性 免疫組化結果顯示，在GOLPH3陽性表達組的胃癌組織中，VEGF陽性表達率為75.68%(28/37)，明顯高于GOLPH3陰性表達組22.22%(4/18)。采用Pearson相關性分析顯示，GOLPH3蛋白的表達與VEGF的表達呈正相關性 (r=0.508，P<0.01)。

3 討論

研究[6]顯示，GOLPH3參與執行高爾基體的蛋白質分選功能，在蛋白質的整合、受體循環以及蛋白質的糖基化過程中起重要作用。Scott et al[3]對多種實體腫瘤的5p13基因拷貝數增加進行系統性分析，并通過基因敲除實驗發現，GOLPH3可能是新的致癌基因，影響腫瘤發生與發展。相關文獻[7-11]報道，GOLPH3在食管癌、乳腺癌、結腸癌、神經膠質瘤及卵巢上皮細胞癌等多種惡性腫瘤中存在高表達現象。GOLPH3在惡性腫瘤中的高表達產物與相關惡性腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、預后等密切相關，也證實GOLPH3是一種致癌基因，且其表達產物在癌癥的發生和進展過程中有重要作用，影響癌癥患者預后。GOLPH3的高表達通過調節高爾基體蛋白質糖基化轉移酶的活性及功能，使腫瘤相關蛋白的分泌異常；蛋白質的糖基化結構與腫瘤的細胞生長、黏附、遷移和侵襲都密切相關，從而導致腫瘤細胞的侵襲性增強[12-13]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是細胞內磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT)/mTOR信號通路的中心調控位點，已有研究[14]證實此信號通路對細胞的增殖、凋亡有著重要的調控作用，mTOR的異常激活參與了多種腫瘤的形成與進展。Scott et al[3]通過比較基因組雜交分析發現GOLPH3與retromer復合體的重要組成部分VPS35存在密切相關性，從而通過這種方式將GOLPH3與mTOR聯系起來，推測GOLPH3通過mTOR信號通路對惡性腫瘤的生長產生影響。本研究結果顯示，GOLPH3在胃癌組織中陽性表達率為67.27%，明顯高于相應癌旁組織的18.18%，且GOLPH3的高表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期呈正相關性。

表2 GOLPH3、VEGF表達與胃癌患者各臨床病理特征之間的關系

實體腫瘤無限制的侵襲性生長及轉移都依賴腫瘤組織中新生血管的形成，而上調的腫瘤血管化作用以及增加的腫瘤促血管生成因子的表達已經證實與腫瘤的分級或者預后相關。VEGF是已知的腫瘤血管生成過程中特異性最強的促血管生長因子，具有明顯的促血管生成作用。VEGF的表達受多因素的調控，最重要的因素是低氧。低氧可誘導低氧誘導因子1α(HIF-1α)從而上調VEGF的表達。VEGF的表達與癌癥的轉移、復發和預后等密切相關。本研究結果顯示，VEGF在胃癌組織的陽性表達率明顯高于相應癌旁組織，并且VEGF高表達的胃癌患者與其組織學分級、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期密切相關，提示VEGF的高表達可能促進胃癌的浸潤和轉移。

本研究結果顯示GOLPH3和VEGF均與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移以及TNM分期相關，提示二者可能對胃癌的進展存在某種協同作用。同時，經相關性分析顯示，胃癌組織中GOLPH3的高表達與VEGF的表達呈明顯正相關性，提示胃癌組織中過表達的GOLPH3可能通過誘導上調VEGF的表達，從而促進胃癌組織中新生血管的形成，進一步影響胃癌組織的生長和發展。其機制可能是GOLPH3通過激活細胞內的PI3K/AKT/mTOR信號通路，上調HIF-1α的表達，從而促使VEGF的表達增加，使內皮細胞遷移形成新生血管增加腫瘤細胞的血供，促進腫瘤的生長[15]。

綜上所述，胃癌組織中GOLPH3、VEGF的陽性表達與胃癌的進展程度均密切相關，提示二者對胃癌進展的診斷有協同作用，并且胃癌組織中過表達的GOLPH3可能上調VEGF的表達，從而促進胃癌新生血管的形成，促進胃癌的生長及發展。針對腫瘤血管生成各環節的靶向治療是近年來腫瘤研究熱點，抗血管生成藥物也逐漸運用于腫瘤的臨床治療。因此，聯合檢測GOLPH3和VEGF的表達，可能對胃癌病理診斷、臨床預后的判斷及豐富胃癌的臨床治療手段有一定的指導意義。

[1] Jemal A, Bray F, Center M M, et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

[2] Bell A W, Ward M A, Blackstock W P, et al. Proteomics characterization of abundant Golgi membrane proteins [J]. J Biol Chem,2001,276(7): 5152-65.

[3] Scott K L,Kabbarah O,Liang M C,et al.GOLPH3 modulates mTOR signaling and rapamycin sensitivity in cancer [J]. Nature,2009, 459(7250):1085-90.

[4] Hu B S, Hu H, Zhu C Y, et al. Overexpression of GOLPH3 is associated with poor clinical outcome in gastric cancer [J]. Tumour Biol, 2013, 34(1): 515-20.

[5] 鄒紹武,江積瑞,孟翔凌,等. VEGF表達和血管生成與胃癌浸潤、轉移及預后的關系 [J]. 安徽醫科大學學報,2001,36(4):260-3.

[6] Nagano-Ito M, Yoshikawa S, Tamura M, et al. Identification and characterization of a novel alternative splice variant of mouse GMx33alpha/GPP34 [J]. Gene, 2007,400(1-2): 82-8.

[7] Wang J H, Chen X T, Wen Z S, et al. High expression of GOLPH3 in esophageal squamous cell carcinoma correlates with poor prognosis [J]. PLoS One, 2012,7(10):e45622.

[8] Zeng Z, Lin H, Zhao X, et al. Overexpression of GOLPH3 promotes proliferation and tumorigenicity in breast cancerviasuppression of the FOXO1 transcription factor [J]. Clin Cancer Res, 2012,18(15):4059-69.

[9] Wang Z, Jiang B, Chen L, et al. GOLPH3 predicts survival of colorectal cancer patients treated with 5-fluorouracil-based adjuvant chemotherapy [J]. J Transl Med, 2014,12:15.

[10] Li X Y, Liu W, Chen S F, et al. Expression of Golgi phosphoprotein-3 gene in human gliomas: a pilot study [J]. J Neurooncol, 2011,105(2):159-63.

[11] Ma Y, Wang X, Wu Y, et al. Overexpression of GOLPH3 is associated with worse prognosis in patients epithelial ovarian cancer [J]. Tumour Biol, 2014,35(12): 11845-9.

[12] Scott K L, Chin L. Signaling from the Golgi: mechanisms and models for Golgi phosphoprotein 3-mediated oncogenesis [J]. Clin Cancer Res, 2010, 16(8):2229-34.

[13] Zhao Y, Sato Y, Isaji T, et al. Branched N-glycans regulate the biological functions of integrins and cadherins [J]. FEBS J, 2008,275(9):1939-48.

[14] Seeliger H, Guba M, kleespies A, et al. Role of mTOR in solid tumor systems: a therapeutical target against primary tumor growth, metastases, and angiogenesis [J]. Cancer Metastasis Rev, 2007,26(3-4):611-21.

[15] Nakamura J L, Garcia E, Pieper R O. S6K1 plays a key role in glial transformation [J]. Cancer Res, 2008,68(16): 6516-23.

Relationship between the expression of GOLPH3 with VEGF expression in gastric cancer

Chan Shixin, Meng Xiangling, Wu Wenyong

(Dept of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022)

Objective To investigate the interrelationship between Golgi phosphoprotein 3(GOLPH3) expression with vasculoar endothelial growth factor(VEGF) expression in the progression of human gastric cancer by detecting the expression level of GOLPH3 and VEGF. Methods Immunohistochemistry (IHC) was used to detect the expression of GOLPH3 and VEGF in 55 cases of gastric cancerous and carcinoma-adjacent tissues. Pearson correlation analysis was used to discuss the association between GOLPH3 expression with VEGF expression. Results The immunohistochemical detection showed that the positive expression rates of GOLPH3 and VEGF were 67.27%,58.18% respectively, which were significantly higher than the positive expression rates in carcinoma-adjacent tissues (P<0.05). A statistical analysis revealed that the positive expression rate of GOLPH3 and VEGF in the gastric cancer tissues were strongly correlated with depth of invasion (P<0.05), distant metastasis (P<0.01) and TNM stages (P<0.01), whereas it did not significantly correlate with age or gender or size of tumor. Compared with the negative for the GOLPH3 expression, the VEGF expression in gastric cancer tissues positive for the GOLPH3 expression was significantly higher. The protein level of GOLPH3 expression was positively correlated with VEGF expression (r=0.508,P<0.01). Conclusion GOLPH3 overexpression may regulate gastric angiogenesis by upregulating the expression of VEGF, which affects the invasion and metastasis of gastric cancer.

gastric cancer; GOLPH3; VEGF; angiogenesis

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.040.html

安徽省科技攻關項目(編號：07010300196)；安徽省高等學校博士學科點專項科研基金聯合資助項目(編號：20133420120006)

安徽醫科大學第一附屬醫院普通外科，合肥 230022

產世鑫，男，碩士研究生；

孟翔凌，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：xianglingm@medmail.com.cn

R 735.2

A

1000-1492(2016)01-0086-04

2015-10-13接收