2，4，6?三硝基苯磺酸誘導不同鼠種急性潰瘍性結腸炎的比較

郭瑞敏，荀哲，范正松，牛亞玲，李雁春

2，4，6?三硝基苯磺酸誘導不同鼠種急性潰瘍性結腸炎的比較

郭瑞敏，荀哲，范正松，牛亞玲，李雁春

（中國醫科大學代謝病分子機制與藥物研究所，沈陽 110122）

目的利用2，4，6?三硝基苯磺酸（TNBS）誘導C57BL/6小鼠和昆明小鼠建立潰瘍性結腸炎模型，對比2種小鼠的造模效果。方法小鼠經結腸灌注一定劑量的TNBS，評估病情，于72 h后處死小鼠，取出結腸進行組織學切片評分，并用Western blot及RT?PCR方法檢測炎性因子的表達。結果C57BL/6小鼠和昆明小鼠的急性潰瘍性結腸炎模型建立成功，但C57BL/6小鼠腸炎在分子水平和組織水平上均比昆明小鼠更加嚴重。結論C57BL/6小鼠比昆明小鼠對TNBS更敏感，組織學上更易觀察到病理變化。C57BL/6小鼠比昆明小鼠更適合用于潰瘍性結腸炎的研究。

潰瘍性結腸炎；C57BL/6小鼠；昆明小鼠；2，4，6?三硝基苯磺酸

網絡出版地址

潰瘍性結腸炎是一種病因尚不完全明確的慢性腸道炎癥性疾?。?］，主要侵及結腸黏膜，破壞黏膜并形成潰瘍，常始自左半結腸，可由結腸近端發展至全結腸［2］，以連續方式逐漸進展。臨床表現主要為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，且易反復發作，病程長，遷延不愈［3］。

目前已有多種潰瘍性結腸炎動物模型，但由2，4，6?三硝基苯磺酸（2，4，6?trinitrobenzene，TNBS）和乙醇混合試劑誘導建立的急性潰瘍性結腸炎動物模型，雖然時間較短、操作簡便，基礎研究中應用較普遍［4］，但重復性差，使得造模效率下降。TNBS混合試劑的致炎機制是乙醇破壞腸黏膜屏障，TNBS滲入結腸黏膜組織作為化學性半抗原與結腸組織蛋白結合形成全抗原［5］，直接活化腸黏膜固有層中的巨噬細胞，促使其增生并且釋放多種促炎性細胞因子、組胺、白三烯、血小板活化因子、肝素等。促炎性細胞因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）可以通過活化內皮細胞整連素的表達，增加細胞內Ca2+濃度，同時釋放血小板活化因子，使淋巴細胞、白細胞、血小板黏附到腸黏膜內皮細胞上，活化一氧化氮合酶，產生大量一氧化氮，引起細胞損傷，形成潰瘍；TNF?α亦可促使白細胞介素IL?1β、IL?2、IL?8等的釋放，進一步損傷腸黏膜屏障［6?7］。

誘導模型過程中所使用的試劑、實驗動物種類和遺傳背景及實驗方法都對模型的成功建立產生不同程度的影響。本研究試圖通過針對C57BL/6小鼠和昆明小鼠實驗結果的對比，對造模過程中遇到的問題做出分析比較，提供可靠的參考資料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑：TNBS（美國Sigma公司）；膠體金便隱血檢測試劑盒（艾博生物醫藥有限公司）；HE染色試劑盒（上海碧云天生物公司）；蛋白酶抑制劑ULTRA（上海嶸崴達實業有限公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物公司）；羊抗鼠TNF?α單克隆抗體（美國Sigma公司）；羊抗鼠β?actin單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG（美國Santa Cruz公司）；ECL發光液（美國Thermo Fisher公司）；Trizol（美國Life Technologies公司）；鼠TNF?α和鼠GAPDH引物（上海生工生物工程公司）；逆轉錄試劑盒（日本Ta?KaRa公司）；PCR擴增試劑盒（日本TaKaRa公司）。

1.1.2動物：SPF級昆明小鼠，體質量23～25 g，周齡8～10周，購于遼寧省長生生物技術有限公司，動物合格證書編號SCXK（遼）2015?0003；SPF級C57BL/6小鼠，體質量20～23 g，周齡8～10周，購于遼寧省長生生物技術有限公司，動物合格證書編號SCXK（遼）2015?0001。

1.1.3器材：RM2235輪轉石蠟切片機（美國Leica公司）；KD?BM生物組織包埋機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；DMI3000B熒光顯微鏡（美國Lei?ca公司）；組織粉碎機（德國IKA公司）；微波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Nano Drop ND?1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計（美國Gene公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio?Rad公司）。

1.2方法

1.2.1動物分組：將10只同一窩別的C57BL/6雄性小鼠隨機分為2組，每組5只，分別為對照組和模型組；將10只同一窩別的昆明雄性小鼠也隨機分為2組，每組5只，分別為對照組和模型組。

1.2.2試劑配制：TNBS與無水乙醇以1∶1的比例混合［8］。

1.2.3模型制作：各組小鼠在造模前禁食不禁飲24 h，灌腸前充分排便。根據小鼠體質量和種系的差別，昆明小鼠的麻醉用藥量為0.5 mL/100 g，C57BL/6小鼠麻醉用藥量為0.25 mL/100 g。將麻醉的小鼠倒置懸掛，用帶有灌腸針的注射器以0.5 mL/100 g的劑量灌注TNBS混合試劑。灌腸針輕輕插入約4 cm，緩慢推入試劑，輕輕拔出針管，倒置約5 min，以保證造模液與結腸充分接觸和防止造模液外溢，然后放回籠內［9］。造模完成后注意保溫，直至自然蘇醒。對照組用同樣的方法灌入相同劑量的無水乙醇。

1.2.4觀察：每天稱量并記錄小鼠體質量，觀察糞便、毛發及活動情況，肉眼不可見的血便采用便隱血檢測試劑評分。第3天后，統計小鼠體質量下降的終值，糞便稀軟程度及便隱血情況，根據JACK?SON等［10］的疾病活性指數（disease activity index，DAI）評分方法繪制表格，見表1。

表1　DAI評分標準Tab.1　DAI scoring system

1.2.5取材：造模72 h后將各組小鼠處死，取出結腸，用4℃冷卻的PBS液將腸內容物清理干凈。用作組織切片的部分放置到4%的多聚甲醛溶液固定24 h；用作Western blot和RT?PCR檢測的部分放至-80℃的冰箱里凍存備用［11］。

1.2.6組織切片制作及觀察：多聚甲醛中固定好的組織用流水沖洗，依次使用70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、Ⅱ的梯度乙醇脫水，再用二甲苯Ⅰ、Ⅱ將組織進行透明處理，常規石蠟包埋，切片，厚度約為4 μm，HE染色，分別于5倍、10倍物鏡下觀察各組小鼠結腸組織學變化［11］，并依據STEFAN等的評分標準［8］對病理切片進行評分。見表2。

1.2.7Western blot分析：使用已加入適量蛋白酶抑制劑ULTRA的RIPA裂解液，分別提取上述模型組及對照組小鼠的結腸黏膜組織總蛋白，加入適量loading buffer，加熱變性后，用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）分離，分離后的蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉聚偏氟乙烯膜1 h，再用TBST稍加漂洗。一抗是濃度1∶1 000的羊抗鼠抗體，于4℃冷柜孵育過夜后，用TBST洗膜3次，每次10 min；然后加入二抗，二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG，稀釋濃度為1∶2 000；之后于室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次，最后將膜與ECL試劑反應一定時間。X光片顯影，定影后掃描，使用Im?age J對蛋白表達做定量分析。抗β?actin為內參照。

1.2.8RT?PCR：使用Trizol試劑提取各組小鼠結腸組織的總RNA，測定濃度，取500 ng應用逆轉錄試劑盒逆轉錄出cDNA，最后用實時定量PCR儀檢測組織中TNF?α的表達量［12］。內參采用GAPDH，TNF?α寡核苷酸引物序列為上游5′?TCAGCCTCTTCTCAT TCCTG?3′；下游5′?CAGGCTTGTCACTCGAATTT?3′，mGAPDH寡核苷酸序列為：上游5′?TGTGTCCGTCG TGGATCTG?3′；下游5′?CCTGCTTCACCACCTTCTTG A?3′［13］。反應條件為95℃預變性5 min，95℃60 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個循環。結果采用比較閾值法進行定量分析，計算目的基因的拷貝數并比較［14］。

表2　結腸組織炎癥相關變化評分標準Tab.2　Scoring system for inflammation?associated histological changes in the colon

1.3統計學分析

2　結果

2.1小鼠DAI評分結果

小鼠被處理后的第2天，對照組糞便無異常，TNBS模型組會出現大便稀軟的現象；第3天，嚴重的會出現稀水樣便，隱血便或肉眼可見血便。C57BL/6小鼠的平均值約為昆明小鼠的1.5倍，體質量下降程度，大便稀軟程度及出現血便的概率均比昆明小鼠大。說明使用C57BL/6小鼠制作模型更容易成功。見表3。

表3　DAI評分結果Tab.3　DAI scores

2.2小鼠體質量變化

各組小鼠體質量變化曲線如圖1所示：C57BL/6小鼠和昆明小鼠體質量下降趨勢基本一致。造模后第3天，C57BL/6模型組小鼠體質量下降了將近20%（圖1A）；昆明小鼠體質量下降幅度略小，約為12%（圖1B）。說明C57BL/6小鼠對TNBS的敏感性比昆明小鼠高。

圖1　C57BL/6小鼠和昆明小鼠接受TNBS處理后的體質量變化曲線Fig.1　Body weight change curves of C57BL/6 mice and kunming mice after TNBS treatment

2.3結腸組織病理變化

將各組小鼠的病理組織切片進行觀察比較后的評分結果如表4所示。C57BL/6小鼠和昆明小鼠的對照組無顯著變化，僅在無水乙醇的作用下，前者較后者略微敏感。TNBS模型組均有統計學差異，且C57BL/6小鼠的平均值要大于昆明小鼠，約為昆明小鼠的1.7倍。各組小鼠病理組織切片如圖2所示。2種小鼠對照組無明顯差異，但C57BL/6模型組的變化比昆明小鼠的變化更加明顯。TNBS處理3 d后，結腸黏膜的基本組織結構（包括腺體和杯狀細胞）基本全部消失，血管密度增加，白細胞顯著增多，肌層變厚；而昆明小鼠炎癥最嚴重的部位仍部分保留腸黏膜的基本結構，部分腺體和杯狀細胞未完全消失。說明灌腸相同劑量的TNBS混合液，C57BL/6小鼠腸黏膜組織結構的破壞比昆明小鼠更明顯。

表4　結腸組織炎癥變化的評分結果Tab.4　Scores for inflammation?associated histological changes in the colon

圖2　組織切片 HE染色×20Fig.2　Histological section HE×20

2.4腸黏膜上皮細胞TNF?αmRNA表達

TNBS處理3 d后C57BL/6小鼠和昆明小鼠的結腸黏膜上皮細胞TNF?α在mRNA水平的表達均有增加。與對照組比較，C57BL/6小鼠的TNF?αmRNA增加15倍左右（P＜0.01），而昆明小鼠的TNF?α mRNA表達只增加5倍左右（P＜0.05）。 所以C57BL/6小鼠的TNF?α在mRNA水平的表達量增加較大，說明炎癥更加嚴重。見圖3。

圖3　腸黏膜上皮細胞TNF?α mRNA的表達Fig.3　Mucosal epithelial cell TNF?α mRNA expression

2.4腸黏膜上皮細胞TNF?α的蛋白質表達

通過Western blot對2種小鼠腸黏膜上皮細胞中的炎性因子TNF?α在蛋白水平表達做進一步檢測，發現2種小鼠對照組TNF?α表達都很低，而TN? BS刺激后，2種模型的TNF?α蛋白水平都有明顯的增加。定量結果顯示，C57BL/6小鼠和昆明小鼠的腸黏膜上皮細胞TNF?α蛋白表達分別增加6.8倍和5倍左右，差異有統計學意義（P＜0.01），結果和mRNA變化水平基本一致。這進一步說明在TNBS處理后，C57BL/6小鼠的腸黏膜炎性反應比昆明小鼠嚴重。見圖4。

圖4　腸黏膜上皮細胞TNF?α蛋白的表達和定量分析Fig.4　Mucosal epithelial cell TNF?α protein expression and quantitative analysis

3　討論

C57BL/6小鼠被稱作“標準”近交系小鼠，是腫瘤學、免疫學、病理生理學、遺傳學及藥理學研究中常用的鼠種。昆明小鼠則是一種遠交系品種，基因庫大，基因雜合率高。與C57BL/6小鼠比較，昆明小鼠抵抗力和適應力均很強，且繁殖率和成活率較高［15］。本研究通過對比由TNBS混合液誘導的2種小鼠潰瘍性結腸炎模型發現，在造模的第2天，各組小鼠出現不同程度的厭食、懶動、皮毛粗糙無光澤，腹部扭曲，膨大，糞便呈黏液狀或稀水樣便甚至隱血便。C57BL/6小鼠和昆明小鼠在接受TNBS混合液處理后，表現出的體質量下降趨勢是基本相同的，都在72 h后體質量降到最低值，但C57BL/6小鼠比昆明小鼠下降更多，出現稀軟糞便和血便的概率更大，DAI評分約為昆明小鼠的1.5倍。通過病理組織切片可以看到，在灌腸同樣劑量TNBS的情況下，C57BL/6小鼠的炎性反應更嚴重，腸黏膜結構嚴重破壞，杯狀細胞、腺體和絨毛上皮細胞基本消失，血管密度增加，白細胞浸潤嚴重，肌層變厚；而昆明鼠的結腸組織結構變化較小，最嚴重的情況仍可觀察到杯狀細胞和腺體的存在，肌層結構變化亦不顯著，組織評分結果與小鼠病癥變化一致。但通過Western blot和RT?PCR對炎性因子TNF?α的檢測，進一步在分子水平上證實，雖然2種小鼠都有炎癥，但C57BL/6小鼠的腸黏膜炎癥程度比昆明小鼠更嚴重。當使用較高劑量的TNBS刺激昆明小鼠并誘導其產生炎癥后，在組織水平并未發現明顯病變特征，但在mRNA水平和蛋白水平卻可以檢測到炎性因子的表達，加之該模型的誘導為急性發作，組織可在短期內自我修復，在視覺觀察上易誤斷為造模失敗。

綜上所述，在選擇TNBS誘導小鼠急性潰瘍性結腸炎時，由于C57BL/6小鼠對TNBS的高敏感性，結腸炎表現更加顯著，且造模成功率較高，降低了實驗成本，改善了反復造模的繁瑣性。雖然昆明小鼠價格相對便宜，但從實驗整體的性價比來說并非理想品種。

［1］KHALILI H，HIGUCHI LM，ANANTHAKRISHNAN AN，et al.Hor?mone therapy increases risk of ulcerative colitis but not crohn′s dis?ease［J］.Gastroenterology，2012，143（5）：1199-1206.DOI：10.1053/ 10.1053/j.gastro.2012.07.096.Epub 2012 Jul 27.

［2］LICHTENSTEIN GR.The history of medical therapy of ulcerative colitis［M］.Berlin：Springer，2014：45-54.

［3］LICHTENSTEIN GR.The history of medical therapy of ulcerativecolitis［M］.Berlin：Springer，2014：31-44.

［4］張冰冰，齊越，賈冬，等.2，4，6?三硝基苯磺酸誘導潰瘍性結腸炎大鼠模型的建立及評價［J］.中華中醫藥學刊，2015，33（8）：1834-1836.DOI：10.13193/j.issn.1673?7717.2015.08.011.

［5］徐陽，李偉光，劉海峰，等.三硝基苯磺酸誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型制備的技術改良［J］.世界華人消化雜志，2012，（2）：106-112.

［6］LEE J，CLARKE K.Anti?TNF agents in patients with inflammatory bowel disease and malignant melanoma—challenges in management［J］.Int J Colorectal Dis，2015，30（12）：1595-1602.DOI：10.1007/ s00384?015?2344?1.Epub 2015 Sep 8.

［7］FUKUMOTO K，NAITO Y，TAKAGI T，et al.Role of tumor necrosis factor?α in the pathogenesis of indomethacin?induced small intesti?nal injury in mice［J］.Int J Mol Med，2011，27（3）：353-359.DOI：10.3892/ijmm.2011.602.Epub 2011 Jan 18.

［8］STEFAN W，CLEMENS N，BENNO W，et al.Chemically induced mouse models of intestinal inflammation［J］.Nat Protoc，2007，2（3）：541-546.DOI：10.1038/nprot.2007.41.

［9］DA FC，LUN GL，KAI ZT，et al.Recovery from TNBS?induced coli?tis leads to the resistance to recurrent colitis and an increased ratio of FOXP3 to CD3 mRNA［J］.J Dig Dis，2013，14（11）：587-595. DOI：10.1111/1751?2980.12084.

［10］JACKSON LN，ZHOU Y，QIU S，et al.Alternative medicine prod? ucts as a novel treatment strategy for inflammatory bowel disease［J］.Am J Chin Med，2007，36（5）：953-965.DOI：http：//dx.doi. org/10.1142/S0192415X08006375.

［11］LIU W，CHEN Y，GOLAN MA，et al.Intestinal epithelial vitamin D receptor signaling inhibits experimental colitis［J］.J Clin In?vest，2013，123（9）：3983-3996.DOI：10.1172/JCI65842.Epub 2013 Aug 15.

［12］FEI Z，WEI W，XING Y，et al.NF?κB target microRNAs and their target genes in TNFα?stimulated HeLa cells［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1839（4）：344-354.DOI：10.1016/j.bbagrm.2014.01. 006.Epub 2014 Jan 11.

［13］DU J，CHEN Y，SHI Y，et al.1，25?dihydroxyvitamind protects in?testinal epithelial barrier by regulating the myosin light chain ki?nase signaling pathway［J］.Inflamm Bowel Dis，2015，21（11）：2495-2506.DOI：10.1097/MIB.0000000000000526.

［14］VANDESOMPELE J，PRETER KD，PATTYN F，et al.Accurate normalization of real?time quantitative RT?PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes［J］.Genome Biol，2002，3（7）：research0034.

［15］ZHANG X，ZHU Z，HUANG Z，et al.Microsatellite genotyping for four expected inbred mouse strains from KM mice［J］.J Genet Ge?nomics，2007，34（3）：214-222.

（編輯于溪）

Comparison of 2，4，6?trinitrobenzene Sulfonic Acid?induced Acute Colitis Models in Two Different Mouse Strains

GUO Ruimin，XUN Zhe，FAN Zhengsong，NIU Yaling，LI Yanchun
（Institute of Metabolic Disease Research and Drug Development，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveAcute colitis was induced with 2，4，6?trinitrobenzene sulfonic acid（TNBS）in C57BL/6 and Kunming mice，and effec?tiveness of the colitis model in these two mouse strains was compared.MethodsMice were treated with TNBS and sacrificed after 72 h.The co?lons were collected for histological observation，and the expression of colonic mucosal pro?inflammatory cytokines was assessed by western blot and real time RT?PCR.Disease severity and mucosal histological damages were scored.ResultsColitis was successfully induced in both C57BL/6 and Kunming mice，but colonic pathological lesions and inflammation were more severe in C57BL/6 mice than in Kunming mice at both histologi?cal and molecular levels.ConclusionC57BL/6 mice were more susceptible to TNBS than Kunming mice in colitis development，and histological damages were more prominent in C57BL/6 mice.Thus，C57BL/6 mice are more suitable for experimental colitis research.

colitis；C57BL/6 mouse；Kunming mouse；2，4，6?trinitrobenzene

R326.2

A

0258-4646（2016）09-0787-06

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.09.005

遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2014320）

郭瑞敏（1988-），女，碩士研究生.

李雁春，E-mail：cyan@medicine.bsd.uchicago.edu

2016-01-22

網絡出版時間：