芹菜素通過抑制Src通路抑制黑色素瘤細胞增殖

郭冰玉，張宇，回薔，常鵬，陶凱

芹菜素通過抑制Src通路抑制黑色素瘤細胞增殖

郭冰玉，張宇，回薔，常鵬，陶凱

（沈陽軍區總醫院整形外科，沈陽 110840）

目的探討芹菜素如何通過調節Src通路來抑制黑色素瘤細胞增殖。方法采用不同濃度的芹菜素處理黑色素瘤細胞系A375，使用HEK293細胞系（正常細胞系）作為對照，通過MTT實驗觀察芹菜素是否可以特異性抑制腫瘤細胞的增殖。進一步通過Western blot以及實時PCR檢測芹菜素對A375細胞中Src通路增殖相關蛋白CDK4和CDK6的影響。結果MTT檢測結果發現芹菜素對HEK293細胞的增殖抑制作用不明顯，但是10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L與80 μmol/L的芹菜素分別作用于A375細胞后對細胞增殖的抑制率分別為（22.12±7.20）%、（27.08±4.37）%、（37.39±2.72）%和（39.00±1.57）%，而且隨著藥物的濃度增加對A375細胞增殖的抑制率增加。Western blot和實時PCR檢測發現，20 μmol/L、40 μmol/L與80 μmol/L的芹菜素均可以抑制A375細胞中Src通路下游CDK4和CDK6蛋白的表達。結論芹菜素可以通過抑制Src通路顯著抑制黑色素瘤細胞系A375的增殖，對正常細胞作用較小，可以作為潛在的化療藥物應用于黑色素瘤的化療。

芹菜素；黑色素瘤；A375；增殖；Src

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惡性黑色素瘤作為一種惡性程度極高的皮膚腫瘤，是皮膚疾病中死亡率最高的疾病［1］。黑色素瘤具有發病隱蔽、生長快、侵襲轉移能力強等特點，往往發現較晚［1］，通常發現時已經發生深層浸潤甚至遠隔臟器轉移。目前黑色素瘤的發病機制并不十分清楚，其發生發展與遺傳因素以及生活方式密切相關，年齡、性別、家族史、激素、吸煙、陽光照射等多種因素都與其發病密切相關，對其機制的研究仍需不斷深入。

黃酮類化合物是一類天然多酚類化合物，泛指擁有2個酚羥基的芳香環，而且由中央三碳鏈相互作用連接而形成的一系列化合物。黃酮類化合物由于其結構特征不同表現出不同的生物學活性，目前常見的有細胞信號的活化、抗炎、抗病毒、抗血管生成、抗氧化、抗腫瘤與促進免疫等多種生物學作用［2］。芹菜素是一種天然的環酮類化合物，化學式為C15H10O5，分子量為270.25，是中藥半枝蓮、紫花地丁等的主要成分，比其他黃酮類化合物毒性低，所>以應用極為廣泛［3］。由于芹菜素具有一定的抗腫瘤活性，其作為腫瘤的化學預防與潛在化療藥物被廣泛研究［4］。目前的研究表明芹菜素具有多種生物學活性與藥理作用，它具有抗突變、抗病毒、抗炎、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、阻滯細胞周期、減少氧化應激、清除自由基等作用［5-6］。但是，關于芹菜素對黑色素瘤細胞系作用的研究較少。

本研究以人黑色素瘤細胞系A375作為研究對象，探討芹菜素對黑色素瘤細胞增殖的抑制作用，并進一步檢測芹菜素對其Src通路蛋白的調節作用，為臨床上黑色素瘤的化療提供新的方案。

1　材料與方法

1.1材料

人黑色素瘤細胞系A375、人胚腎細胞系HEK293（實驗室凍存），DMEM培養基（美國Hy?Clone公司），胎牛血清（天津灝洋生物制品科技有限責任公司），芹菜素（大連美侖生物技術有限公司），四甲基偶氮唑藍、DMSO（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養：將A375細胞與HEK293細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中，置CO2培養箱中培養。

1.2.2MTT實驗：取培養至對數生長期的細胞消化，以1×104/孔的數量接種于96孔培養板中，貼壁后使用10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L與80 μmol/L的芹菜素分別處理細胞，以DMSO處理作為對照。于0、12、24、36和48 h分別加入5 mg/mL MTT 10 μL，培養4 h后棄上清，每孔中加入DMSO 200 μL，溶解后在490 nm處記錄光密度（optical density，OD）值。

1.2.3Western blot：藥物處理24 h后收集細胞，裂解提取蛋白。SDS?PAGE電泳、100 V轉膜1 h后，室溫封閉1 h。一抗過夜，二抗室溫1 h。Src、Srcp?Tyr418、CDK4、CDK6和GAPDH抗體以及相關二抗均購于美國Santa Cruz公司。

1.2.4實時PCR：TRIZOL法提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，進行實時PCR。所用引物為Src，F：5′?GAGTCCTGAGCACCTG?3′，R：5′?CTGTGGGATGTT GTC?3′；CDK4，F：5′?′CTGGTGACAAGTGGTGGAAC?3′，R：5′?GGTCGGCTTCAGAGTTTCC?3′；CDK6，F：5′?GTCTGATTACCTGCTCCGC?3′，R：5′?CCTCGAAG CGAAGTCCTC?3′；GAPDH，F：5′?CATCCCTTCTCCC CACACAC?3′，R：5′?AGTCCCAGGGCTTTGATTTG?3′。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，MTT中不同濃度芹菜素作用于細胞后OD值與對照組的比較，以及不同濃度芹菜素作用細胞后蛋白和mRNA水平與對照組的比較，使用成組設計t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。Western blot數據采用Image J軟件進行分析。

2　結果

2.1芹菜素對HEK293細胞增殖的影響

使用DMSO及10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的芹菜素分別作用于HEK293細胞上，于0、12、24、36和48 h后檢測細胞增殖情況，結果顯示，芹菜素對HEK293細胞的增殖具有一定抑制作用，但是即使是40 μmol/L作用48 h后也未達到50%的抑制率，總體觀察抑制作用并不強。見表1、圖1。

圖1　不同劑量的芹菜素作用下HEK293細胞的增殖情況Fig.1　Proliferation of HEK293 cells treated with different con?centrations of Apigenin

2.2芹菜素對A375細胞增殖的影響

使用DMSO及10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L與80 μmol/L的芹菜素分別作用于A375細胞0、12、24、36和48 h后，結果發現不同濃度的芹菜素均可以抑制A375細胞的增殖，不同濃度的芹菜素對A375細胞增殖的抑制作用與DMSO比較有統計學差異（P＜0.05），并且芹菜素對細胞增殖的抑制作用隨著作用濃度和作用時間的增加而增加。見表2、圖2。

2.3不同濃度芹菜素對Src通路相關蛋白的影響

10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L與80 μmol/L的芹菜素作用于A375細胞24 h后，如圖3、表3所示，芹菜素對Src信號通路蛋白Srcp?Tyr418及下游蛋白CDK4和CDK6均有一定程度的抑制作用，并且這種抑制作用具有濃度依賴性，對Src總蛋白幾乎無作用。

表1　不同濃度的芹菜素在不同時間點對HEK293細胞增殖的抑制率（%）Tab.1　The inhibition of proliferation of HEK293 cells treated with different concentrations of Apigenin at different time points（%）

表2　不同濃度的芹菜素在不同時間點對A375細胞增殖的抑制率（%）Tab.2　The inhibition of proliferation of A375 cells treated with different concentrations of Apigenin at different time points（%）

1）P＜0.05 vs DMSO group；2）P＜0.05 vs 10 μmol/L Apigenin group at the same time point；3）P＜0.05 vs 20 μmol/L Apigenin group at the same time point；4）P＜0.05 vs 12 h within group；5）P＜0.05 vs 24 h within group.

圖2　不同濃度的芹菜素作用下A375細胞的增殖情況Fig.2　Proliferation of A375 cells treated with different concen?trations of Apigenin

圖3　Western blot檢測不同濃度芹菜素對A375細胞中Srcp?Tyr418、Src、CDK4和CDK6蛋白水平的影響Fig.3　Western blot analysis of Srcp?Tyr418，Src，CDK4 and CDK6 in A375 cells treated with different concentrations of Api?genin

3　討論

雖然惡性黑色素瘤的發病率僅占皮膚腫瘤的1%，但其死亡率一直居皮膚腫瘤死亡率的首位，而且通常具有高度的侵襲轉移能力，經常會轉移至肺、肝、腦等重要器官［7］。惡性黑色素瘤的死亡人數占皮膚腫瘤相關死亡人數的80%左右［8］。目前黑色素瘤很難早發現早治療，一般的治療方案為術后輔以放化療，但是現在的化療藥物通常具有胃腸道反應嚴重、骨髓抑制嚴重等缺點，患者應用后生存質量不佳，有必要尋找新的有效的化療輔助藥物甚至化療藥物對黑色素瘤進行治療。

隨著人類對腫瘤的密切關注并深入研究細胞內信號通路，腫瘤分子靶向治療逐漸成為研究熱點。Src通路與體內的多種信號通路關系密切，可以被多條信號傳導途徑激活，而且Src具有促進腫瘤發生發展的作用［9?10］。目前諸如達沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼等多種Src激酶抑制劑在多種腫瘤中被廣泛應用［11］。Src不僅可以通過促進CDK4、CDK6與cyclin D1等蛋白的表達來促進腫瘤細胞的有絲分裂進程，進而促進腫瘤細胞的增殖，還可以通過促進PI3K/AKT、MAPK與STAT3等多條信號通路來促進腫瘤的發生發展［12?14］。

諸多研究表明，芹菜素可以通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲轉移和抑制腫瘤細胞信號傳導途徑起到抑制腫瘤的作用［15］。目前已有研究［16］表明，芹菜素可以抑制前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和結腸癌等多種腫瘤的發生發展。

表3　不同濃度芹菜素處理后A375細胞中Srcp?Tyr418、Src、CDK4和CDK6蛋白水平的半定量分析Tab.3　Semi?quantitative analysis of Srcp?Tyr418，Src，CDK4 and CDK6 in A375 cells treated with different concentrations of Apigenin

1）P＜0.05 vs DMSO group；2）P＜0.05 vs 20 μmol/L Apigenin group；3）P＜0.05 vs 40 μmol/L Apigenin group.

表4　芹菜素對Src、CDK4、CDK6 mRNA表達水平的調控Tab.4　Apigenin regulates Src，CDK4 and CDK6 mRNA expression

本研究使用不同濃度的芹菜素分別作用正常細胞系HEK293細胞與人黑色素瘤細胞系A375細胞。MTT實驗發現，40 μmol/L芹菜素對HEK293細胞作用36 h時才會有顯著的抑制作用（P= 0.0438）。而10 μmol/L芹菜素作用于A375細胞12 h時對細胞增殖的抑制率就可以達到17.65%（P= 0.0470）。這說明與HEK293細胞比較芹菜素可以特異性抑制A375細胞的增殖情況。影響細胞增殖則很可能對細胞周期有一定抑制作用，因此本研究進一步采用Western blot檢測了不同濃度芹菜素對Srcp?Tyr418、Src、CDK4和CDK6蛋白的作用，結果發現10 μmol/L的芹菜素就可以顯著抑制Srcp?Tyr418、CDK4和CDK6蛋白的表達，芹菜素對蛋白的抑制作用具有劑量依賴性。通過實時PCR還發現芹菜素可以抑制CDK4和CDK6mRNA水平。一系列實驗在一定程度上印證芹了菜素可以抑制Src通路的激活，進而抑制下游的CDK4和CDK6蛋白，從而實現對A375細胞增殖的抑制作用。

本研究表明，芹菜素可以通過抑制黑色素瘤A375細胞Src激酶的活性來達到抑制其增殖的效果，為臨床上黑色素瘤的化療治療提供了更多的選擇與理論基礎。

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（編輯陳姜）

Apigenin Inhibits the Proliferation of A375 Cells by Suppressing the Src Pathway

GUO Bingyu，ZHANG Yu，HUI Qiang，CHANG Peng，TAO Kai
（Reconstructive and Plastic Surgery，The General Hospital of Shenyang Military Region，Shenyang 110840，China）

ObjectiveTo investigate whether Apigenin can inhibit the proliferation of A375 cells by suppressing the Src pathway.Methods HEK 293 cells（as control）and A375 cells were treated with different concentrations of Apigenin.MTT assay was used to observe whether Apigen?in could inhibit the proliferation of A375 cells.Western blot and real?time PCR were done to test the effect of Apigenin on CDK4 and CDK6 expres?sion.ResultsAfter treated with 10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L and 80 μmol/L of Apigenin，the inhibition rate of proliferation on A375 cells were 22.12%±7.20%，27.08%±4.37%，37.39%±2.72%，and 39.00%±1.57%，respectively.It was found that the inhibition rate was increased with the concentration of the drug；however，there was no significant inhibition on HEK293 cells.Western blot and real?time PCR showed that compared with the control group，20 μmol/L，40 μmol/L and 80 μmol/L of Apigenin could significantly inhibit the expressions of CDK4 and CDK6 in A375 cells.ConclusionApigenin can significantly inhibit the proliferation of A375 cells by suppressing the Src pathway，but its role in HEK293 cells is smaller.

Apigenin；melanoma cancer；A375；proliferation；Src

R739.5

A

0258-4646（2016）09-0813-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.09.011

郭冰玉（1989-），女，技師，碩士.

陶凱，E-mail：luzongzhengxing@sina.com

2016-03-15

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