肺炎克雷伯菌攜帶碳青霉烯酶KPC-2基因環境多態性研究

沈平華， 仉 英， 蔣曉飛

·論著·

肺炎克雷伯菌攜帶碳青霉烯酶KPC-2基因環境多態性研究

沈平華1， 仉 英2， 蔣曉飛1

目的 研究復旦大學附屬華山醫院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌廣泛播散初期攜帶blaKPC-2的完整基因結構，獲得其播散的基因背景。方法 收集2006年8月―2009年12月連續不重復的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌42株，進行質粒抽提、blaKPC-2篩選、多位點序列分型（MLST）；隨后設計一系列PCR引物，對blaKPC-2基因結構進行完整測序。結果 MLST分型顯示：34株屬于ST11型，5株屬于ST423，2株屬于ST65，1株屬于ST977。主要發現兩種攜帶blaKPC-2基因結構，A型（8/42）：Tn1721-blaKPC-2-Tn3；B型（34/42）：Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26，且B型結構的兩端序列存在差異。結論 該組中肺炎克雷伯菌攜帶blaKPC-2的基因結構存在多態性，Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26樣結構占優勢。研究獲得的攜帶blaKPC-2基因結構及側翼的完整序列，為進一步正確認識和理解blaKPC-2的播散模式和機制提供了完整的基因背景。

肺炎克雷伯菌； 碳青霉烯類耐藥； KPC-2； 基因環境

碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的全球蔓延，已經成為臨床治療的巨大難題。KPC （Klebsiella pneumoniae carbapenemases）是導致肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥的主要原因[1-2]，而KPC-2是KPC中最常見的類型之一[3]。

2007年，中國浙江杭州地區出現了首個關于KPC-2的報道，該報道中blaKPC-2位于一株臨床肺炎克雷伯菌的質粒pKP048（GenBank accession no： FJ628167.2）上[4]，通過全質粒測序可知blaKPC-2位于一個完整的Tn1721樣轉座子中。此后，在上海地區的一株臨床肺炎克雷伯菌中發現質粒pKPHS2 （GenBank accession no： CP003224.1） 上Tn1721結構被IS26在Tn3的tnpR處打斷，造成tnpATn3和IRL2Tn1721的丟失，形成了Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26樣的新結構[5]。

blaKPC-2的基因環境是了解blaKPC-2播散途徑的重要信息，是進行有效醫院感染控制的基礎。本研究將華山醫院自第1株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的檢出到該耐藥細菌廣泛播散的這段時期內耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌作為一個完整的樣本，應用PCR及測序獲得攜帶blaKPC-2完整的基因結構及側翼序列，希望為下一步深入研究該耐藥基因的播散機制提供全面的基因背景。

1　材料與方法

1.1菌株來源和藥敏試驗

收集上海華山醫院2006年8月－2009年12月連續不重復的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，共42株。全部菌株使用法國生物梅里埃公司VITEKAMS 60全自動細菌鑒定系統鑒定菌種。肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大腸埃希菌ATCC 25922購自衛生部臨床檢驗中心。按照CLSI推薦的紙片擴散法（K-B法）進行抗菌藥物敏感性測試，根據CLSI 2014年版標準判斷結果。藥敏紙片均購自英國 OXOID公司。

1.2方法

1.2.1質粒抽提與耐藥基因blaKPC-2的篩選 采用Qiagen Plasmid Midi kit （Qiagen公司， 德國）抽提野生株質粒，作為后續實驗的DNA模板。Taq DNA聚合酶購自美國Promega公司。采用引物KPCFOR：5'-TCGCTAAACTCGAACAGG-3' 和 KPCREV：5'-TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC-3'[6]，以抽提的質粒為模板，對42株細菌進行PCR，將PCR產物送上海邁浦生物科技有限公司純化后正反雙向測序。

1.2.2多為點序列分型（MLST） 擴增肺炎克雷伯菌基因組上的7個管家基因：gapA、 infB、 mdh、pgi、 phoE、 rpoB、 tonB，將PCR產物送上海邁浦生物科技有限公司純化后測序。參照肺炎克雷伯菌MLST分型網站（http：//www.pasteur.fr/recherche/ genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html）提供的步驟進行分型。

1.2.3攜帶blaKPC-2的基因環境分析 根據pKP048和pKPHS2的序列，設計了一系列PCR引物（圖 1和表1）進行擴增與測序，分別用于檢測本批菌株中是否存在與上述已經報道的blaKPC-2基因環境相同的結構。Junction PCR的引物主要用于確定攜帶blaKPC-2基因結構的界限和區分pKP048和pKPHS2上結構差異的關鍵序列，Mapping PCR主要用于擴增攜帶blaKPC-2基因結構的主干部分，包括M1、M2、 M3、 M4、 M5和M6，見圖1。結合后續的Crossing PCR可以覆蓋整個基因環境的序列。PCR陽性產物純化后測序。

根據Junction PCR和Mapping PCR的結果，當出現區別于以上兩種結構的新結構時，擬采用代表性質粒測序及以純質粒為模板進行 PCR 步移測序等，獲得整個新結構的完整基因環境的序列。引物均由北京六合華大基因科技有限公司（上海分公司）合成。

2　結果

2.1菌株情況和藥敏結果

共收集到42株不重復的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌：2006年1株，2007年3株，2008年6株，2009年32株。其中13株來源于尿液，27株來源于痰液，2株來源于血液。所有菌株均對亞胺培南和美羅培南等碳青霉烯類藥物耐藥。

2.2blablaKPC-2KPC-2的篩選和MLST分型LST

對抽提質粒，采用blaKPC特異性引物進行PCR及測序，結果顯示質粒上均攜帶有blaKPC-2基因。42株耐藥肺炎克雷伯菌 （MLST）分型顯示：34株為ST11型，5株屬于ST423，2株為ST65，1株為ST977。主要的流行型別為ST11型，這與QI等[7]報道一致。

2.3攜帶 blablaKPC-2KPC-2的基因環境分析

Junction PCR和Mapping PCR結果見表2，圖2展示了所有菌株攜帶blaKPC-2的基因結構及該結構兩側的序列。本批菌株檢測到了與pKP048和pKPHS2不同的blaKPC-2的基因環境，存在多態性。

A型為Tn1721-blaKPC-2-Tn3樣結構，顯示具備與pKP048相似的blaKPC-2的基因環境，但仍存在差異，表現為Tn1721的IRR上游序列為parA基因，而不是pKP048的ΔIS26；Tn3的IRL后直接連接一個DNA distortion protein 3-like基因，而不是Tn1721的IRL2。代表性質粒為pHS062105-3（GenBank accession no： KF623109.1）。A型結構，分別位于ST423、ST65、ST97型菌株中。

圖1　Junction PCR和 Mapping PCR引物設計示意圖Figure 1 Schematic map of primer annealing sites for Junction PCR and Mapping PCR

表1　用于本研究PCR的引物Table 1 Primers used in this study

表2　blaKPC-2陽性肺炎克雷伯菌MLST分型與Junction和Mapping PCR結果Table 2 MLST genotyping of blaKPC-2-carrying K. pneumoniae isolates and the result of Junction PCR and Mapping PCR

圖2　A型與B1、B2結構攜帶blaKPC-2基因結構示意圖Figure 2 Schematic representations of blaKPC-2-bearing genetic elements

Genes are depicted as arrows according to the direction of transcription. blaKPC-2is indicated in dark gray. Inverted repeats are indicated by colorvariable， vertical bars shown in corresponding matching colors： Tn1721 （black）， Tn3 （white） and IS26 （gray）. Regions sharing identical or nearidentical sequence across plasmids are indicated by the gray shading between the representations of different plasmids.

B1型顯示具有與pKPHS2相同的blaKPC-2的基因環境，即Tn1721- blaKPC-2-ΔTn3-IS26。且該結構外圍也具備相同的基因結構，即Tn1721的IRR上游連接ΔIS26，IS26下游連接TniA基因。代表質粒為pHS082416 （GenBank accession no：KF724507.1）。

B2型與B1型唯一的區別是J1陰性，以純質粒為模板，應用引物2R向一側步移測序。該型Tn1721的IRR上游序列與肺炎克雷伯菌JM45 plasmid p2 （GenBank accession no：CP006658.1）上的一個功能未知的蛋白序列高度一致，與ΔIS26無相似性。代表型質粒為pHS092753 （GenBank accession no： KF826293.1）。B2和B1結構中IS26的下游均連接著TniA基因。綜上，B1和B2存在相同的骨干結構，且均位于ST11型菌株中。

3　討論

華山醫院分離的第1株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌為ST423型，而廣泛播散時流行的菌株型別為ST11型，區別于國外流行的ST258型[8]，同時也提示碳青霉烯類耐藥性存在菌株間水平傳播。

華山醫院自碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌出現初期，即存在blaKPC-2基因環境的多態性，提示其blaKPC-2播散可能存在不同的來源，為blaKPC-2播散的流行病學調查提供了研究依據。A型首先被發現，并可以穩定存在于不同ST型別的肺炎克雷伯菌中；B型出現晚于A型，推測可能是A型在結構上發生變化而形成，也有可能是外源性侵入而在醫院內廣泛播散。尤其B1與B2存在不同的側翼序列，推測該結構是一種新型的嵌合型可移動元件，可能具備水平轉移的能力，轉移過程中發生了不同位置的插入。

在歐美，導致KPC-2廣泛播散的原因是編碼該酶的基因blaKPC-2主要位于活躍的轉座子（Tn4401）上[9]。中國大陸地區至今還沒有一例關于Tn4401攜帶blaKPC-2的報道。與歐美截然不同的基因環境，提示該耐藥基因在中國可能存在不同的水平轉移機制。

本研究在方法上也有一定的創新：克服了采用全質粒測序后獲得攜帶blaKPC-2基因環境費時費力及難以進行大樣本分析的弊端；同時以往的研究中，通常只是分析blaKPC-2上下游的一小段序列[4，10-12]，而本研究完整展示了攜帶blaKPC-2基因環境，為進一步分析該結構可能的移動模式和機制提供了有價值的基因背景。PCR結合測序獲取耐藥基因周圍環境的方法簡單實用，可以推廣至其他耐藥基因周圍環境序列的檢測。

本研究的局限性在于只檢測了碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌廣泛播散初期2006－2009年攜帶blaKPC-2的基因環境，同時鑒于碳青霉烯類耐藥還廣泛存在于其他腸桿菌科細菌中的事實，下一步研究將在菌株收集的時間和種類上進一步擴展，以獲得華山醫院耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌攜帶blaKPC-2的基因環境，為控制醫院感染提供有價值的信息。

研究顯示，華山醫院碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的主要流行株為ST11型，且臨床數據顯示攜帶耐藥基因blaKPC-2的基因環境存在多態性，提出該耐藥基因的水平播散可能存在不同的機制，為下一步研究該耐藥基因的水平播散模式和機制奠定了研究基礎。

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Diversity of genetic environment of carbapenem-hydrolyzing β-lactamase KPC-2 among Klebsiella pneumoniae

SHEN Pinghua, ZHANG Ying, JIANG Xiaofei. （Department of Laboratory Medicine, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China）

Objective This study was designed to determine the genetic structure bearing blaKPC-2, which prevailed in the clinical K. pneumoniae isolates recovered in Huashan Hospital, Fudan University, and examine the genetic background of blaKPC-2prevalence. Methods Forty-two consecutive and nonduplicate K. pneumoniae strains isolated during the period from August 2006 to December 2009 were included in this study. All strains were subjected to plasmid extraction, blaKPC-2detection, and multilocus sequence typing (MLST). A series of primers were designed to analyze the genetic environment of the blaKPC-2gene. Results MLST genotyping showed that 34 of the K. pneumoniae isolates belonged to ST11, five to ST423, two to ST65 and one to ST977. Two types of blaKPC-2-bearing genetic structures were identifi ed: type A (8/42): Tn1721-blaKPC-2-Tn3; type B (34/42): Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26. The fl anking sequence of type B was distinct. Conclusions The genetic environment of blaKPC-2is diverse. Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26 is the dominant chimeric structure bearing blaKPC-2in this set of clinical K. pneumoniae isolates. The complete genetic structure bearing blaKPC-2and the fl anking sequences characterized in this study will help to further understanding of the mode and mechanism of blaKPC-2dissemination.

Klebsiella pneumoniae; carbapenem resistance; KPC-2; genetic environment

R378.996

A

1009-7708 ( 2016 ) 06-0680-05

10.16718/j.1009-7708.2016.06.002

國家自然科學基金項目（81572031）。

1. 復旦大學附屬華山醫院檢驗醫學科，上海 200040；2. 復旦大學附屬婦產科醫院檢驗醫學科。

沈平華（1989—），女，碩士研究生，現在同濟大學附屬第一婦嬰保健院檢驗科工作，主要從事腸桿菌科細菌耐藥機制研究。

蔣曉飛，E-mail：jiangxi2154@aliyun.com。

2016-01-06

2016-02-17