炎癥性腸病患者中艱難梭菌感染的分子流行特征

秦娟秀， 馬硝惟， 戴穎欣， 王亞楠， 劉 倩， 李 敏

·論著·

炎癥性腸病患者中艱難梭菌感染的分子流行特征

秦娟秀， 馬硝惟， 戴穎欣， 王亞楠， 劉 倩， 李 敏

目的 初步研究上海仁濟醫院炎癥性腸病患者中艱難梭菌的分子流行特征，為炎癥性腸病患者中艱難梭菌感染的監控提供證據。方法 對2014年6月－2015年6月的222份炎癥性腸病腹瀉患者糞便標本進行艱難梭菌毒素檢測和厭氧培養。采用多位點序列分型（MLST）進行分型，傳統PCR方法檢測其毒素基因，瓊脂稀釋法檢測艱難梭菌體外藥物敏感性，同時對炎癥性腸病患者所在病房進行環境中艱難梭菌檢測。結果 222份糞便標本中艱難梭菌的檢出率為13.5 %（30/222），克羅恩病和潰瘍性結腸炎患者中艱難梭菌檢出率為15.7 %（22/140）和9.8 %（8/82），病房環境共檢出4株艱難梭菌。MLST分型22株艱難梭菌為14種ST型，主要型別為ST54型。PCR檢測毒素基因顯示TcdA+TcdB+菌株為主（72.7 %，16/22），未檢出二元毒素。22株艱難梭菌對氯霉素、四環素、氨芐西林、甲硝唑、萬古霉素和美羅培南均敏感，對克林霉素耐藥率較高，為63.6 %，8株對莫西沙星耐藥。結論 炎癥性腸病腹瀉患者中艱難梭菌毒素基因以TcdA+TcdB+型為主，菌株克隆以ST54型為主，該型菌株在病房環境中也有檢出。應當密切監測炎癥性腸病患者中艱難梭菌的感染毒素基因。

艱難梭菌； 炎癥性腸病； 藥敏試驗； 多位點序列分型； 毒力基因

艱難梭菌是革蘭陽性有芽孢的厭氧菌，艱難梭菌毒素A和B是導致腸道炎癥和組織病變的主要致病因子。艱難梭菌引起的感染可從輕微腹瀉發展至假膜性腸炎甚至死亡。僅在美國，2009年艱難梭菌感染比2002年增長了237 %，每年因艱難梭菌感染治療的支付大約1.2～3億美元[1]。

炎癥性腸病是病因尚不十分清楚的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病。在中國地區，WANG等[2]將1989－2003年每5年劃分為一個階段，最后一個5年較第一個5年炎癥性腸病的發病率增加了8.5倍。多篇文獻證明炎癥性腸病患者是艱難梭菌的易感人群，炎癥性腸病患者中艱難梭菌感染的發病率較非炎癥性腸病患者高且呈上升趨勢[3-7]。因此探究炎癥性腸病中艱難梭菌感染傳播情況，尤其是分子流行特征，可以更好地為炎癥性腸病患者艱難梭菌的感染監控提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 收集2014年6月－2015年6月的炎癥性腸病腹瀉患者糞便標本222份進行艱難梭菌篩查。腹瀉的診斷標準為：每天大便次數≥3次，糞便性狀異常，癥狀連續3 d，排除灌腸和瀉藥的使用。炎癥性腸病的分類依據國際疾病分類第9版（ICD-9 555，556）[8]，診斷標準參考文獻[9]。本研究以患者出院診斷來確定疾病的分類，并依據患者的住院號進行查詢統計患者年齡、性別、疾病等相關臨床信息，并收集環境標本檢測艱難梭菌。

1.1.2培養基和抗菌藥物 艱難梭菌的選擇性培養基為CDIF（法國生物梅里埃公司），Brucella瓊脂培養基為美國BD公司生產，抗菌藥物包括氯霉素、四環素、氨芐西林、莫西沙星、甲硝唑、萬古霉素、克林霉素和美羅培南，來自美國Sigma公司。

1.1.3主要儀器與試劑 mini VIDAS儀器，法國生物梅里埃公司；PCR擴增儀，新加坡公司；基質輔助激光解析電離飛行時間質譜分析（MALDI TOF MS），德國BrukerDaltonik公司；PCR試劑盒和細菌基因組提取試劑盒，中國天根有限公司；毒素檢測CDAB試劑盒，法國生物梅里埃公司；DNA Marker，日本TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1艱難梭菌的檢測 對糞便標本同時進行VIDAS熒光酶聯免疫技術檢測A/B毒素，并將標本接種到CDIF進行選擇性厭氧培養48 h。可疑菌落接種到Brucella血平皿（添加劑為5 mg/L血紅素，1 mg/L維生素 K）進行純分，采用MALDI-TOF MS對疑似菌株進行鑒定并同時保存菌株。環境中的艱難梭菌檢測，用無菌棉簽蘸取無菌生理鹽水采集醫務人員、患者、看護人員和運輸人員的手以及病房的物品表面、廁所、門把手和地面標本，接種在CDIF平皿厭氧培養48 h，后續步驟同糞便標本中艱難梭菌的檢測。

1.2.2核糖體分型（PCR ribotype）和多位點序列分型（MLST） PCR核糖體分型參照文獻[10]方法進行。所得分型圖譜以英文字母A、B、C、D等順序進行分型。MLST參考網站http：//pubmlst. org/cdiffi cile/，設計7對管家基因（adk，atpA，dxr， glyA， recA， sodA， tpi）設計引物（引物序列見表1），進行PCR檢測。PCR產物送上海鉑尚有限公司進行雙向測序，測序結果在該網站進行比對[11]。并將7對管家基因拼接，利用MEGA.4建樹，進行進化分析。

1.2.3毒素基因的檢測 對tcdA和tcdB基因進行擴增，對毒素雙陰性菌株利用Lok1/Lok3進行非產毒株的確認。引物序列見表1。同時檢測二元毒素（ctdA和ctdB）。PCR擴增tcdA和tcdB基因的負調控基因tcdC并測序，檢測是否有18 bp的缺失。

1.2.4藥敏試驗 參照CLSI推薦的瓊脂稀釋法測定8種藥物的MIC[12]。將菌懸液調到107CFU/ mL，并取1 μL接種到Brucella血平皿（添加劑為5 mg/L血紅素，1 mg/L維生素 K）。藥敏試驗結果參照CLSI 2015年標準判讀。藥物折點為：氯霉素≥32 mg/L； 氨芐西林≥2 mg/L；四環素≥16 mg/L；甲硝唑≥32 mg/L；莫西沙星≥8 mg/L；美羅培南≥16 mg/L；克林霉素≥8 mg/L。參照歐洲藥物敏感性委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing ，EUCAST）標準，萬古霉素的折點為≥2 mg/L.（clinicalbreak points-bacteria v6.0， http：//www.eucast.org/clinical_breakpoints/）

2　結果

2.1艱難梭菌檢測

收集糞便標本222份，其中克羅恩病患者140份，潰瘍性結腸炎患者82份；環境標本100份。糞便中艱難梭菌檢出率為13.5 % （30/222）（艱難梭菌毒素檢測陽性或培養出毒素陽性菌株），其中A/B毒素檢測方法檢出率為8.1 %（18/222），培養艱難梭菌22株，檢出率為9.9 %（22/222）。克羅恩病患者中艱難梭菌檢出率為15.7 %（22/140），潰瘍性結腸炎患者中檢出率為9.8 %（8/82）。培養方法比毒素檢測方法檢出率高，聯合兩種方法能提高艱難梭菌檢出率。克羅恩病患者中艱難梭菌檢出率較潰瘍性結腸炎患者高。環境中共檢測出4株艱難梭菌，均來自病房廁所。

表1　艱難梭菌MLST、核糖體分型和毒素檢測的相關引物Table 1 Primers used for MLST， PCR ribotyping and detection of toxin genes

2.2基因分型

MLST結果顯示：檢出14種ST型，主要菌株為ST54型（5株），其次為ST2（2株）、ST35（2株）、 ST39 （2株）、ST98（2株）、ST37（1株）、ST139 （1株）、ST81（1株）、ST8 （1株）、ST14 （1株）、ST3（1株）、ST55（1株）、ST102（1株）和ST99（1株）。5株ST54菌株，均來自潰瘍性結腸炎患者。在克羅恩病患者中艱難梭菌的ST型比較分散（圖1）。環境中4株艱難梭菌，ST型為ST54、ST35、ST185和ST81。1株ST185未在患者中檢出，其余3株均在患者中有檢出。進化樹顯示：將菌株分為2部分：MLST Clade1和MLST Clade 4。核糖體分型將艱難梭菌分成7種型別（A、B、C、D、E、F和G）。其中核糖體A型包括ST2、ST3、ST14、ST185和ST102；B型對應ST98；C型對應ST8、ST55和ST99；D型對應ST35和ST135；E對應ST54；F對應ST81和ST37；G對應ST39。

圖1　炎癥性腸病患者和病房環境中感染艱難梭菌的進化分析Figure 1 Evolution of the Clostridium diffi cile strains isolated from patients with infl ammatory bowel disease and their environment

2.3毒素基因檢測

檢出的22株艱難梭菌中：TcdA+TcdB+型菌株16株（72.7 %），TcdA-TcdB+菌株4株（18.2 %）和TcdA-TcdB-菌株2株（9.1 %）。潰瘍性結腸炎患者中8株艱難梭菌均為TcdA+TcdB+菌株；克羅恩病患者中14株艱難梭菌TcdA+TcdB+菌株8株（57.1 %），TcdA-TcdB+菌株4株（28.6 %），TcdATcdB-菌株2株（14.3 %）。TcdA+TcdB+的菌株以ST54/核糖體E為主，TcdA-TcdB+的菌株包括2株ST81和1株ST37，核糖體為F型。TcdA-TcdB-菌株2株則均為ST39/核糖體G型。所有菌株均未檢出二元毒素，也未檢出TcdC基因18 bp的缺失。

2.4藥敏試驗

炎癥性腸病患者中艱難梭菌對克林霉素的耐藥率較高，為63.6 %（14/22），8株艱難梭菌對莫西沙星耐藥。所有菌株對氯霉素、四環素、氨芐西林、甲硝唑、萬古霉素和美羅培南6種藥物均敏感。結果見表2。

3　討論

近年來，艱難梭菌的感染率和嚴重程度均呈不斷上升趨勢，炎癥性腸病患者中艱難梭菌的感染率也呈現上升趨勢。多篇文獻報道炎癥性腸病是艱難梭菌感染的危險因素，BOSSUYT等[13]發現炎癥性腸病患者與非炎癥性腸病患者相比，艱難梭菌的感染率高出3.75倍。KIM等[14]報道炎癥性腸病患者多采用激素和免疫抑制劑治療，腸道生理和解剖結構改變，明顯增加了艱難梭菌感染的風險。

不同方法學對艱難梭菌的檢出率不同，本次調查中我們采取了2種方法，VIDAS熒光酶聯免疫技術檢測A/B毒素和CDIF培養基選擇性培養。后者的檢出率較前者高（9.9 %對 8.1 %），聯合兩種方法可提高艱難梭菌的檢出率（13.5 %），VIDAS檢測毒素操作簡單，結果較快，但靈敏度較低；培養方法操作較為復雜，培養后還需進行PCR鑒定毒素基因，周期較長，但該方法可用于艱難梭菌的分子特征研究。

表2　炎癥性腸病患者感染的艱難梭菌藥敏結果Table 2 Antibiotic resistance patterns in 22 C.diffi cile clinical isolates from patients with infl ammatory bowel disease（mg/L）

不同地區，不同病種患者艱難梭菌的感染率不同。近年來，國外報道炎癥性腸病患者中的艱難梭菌感染發病率為1 %～28 %[3-6]，來自美國、歐洲、日本和印度等國家文獻證明潰瘍性結腸炎患者相比克羅恩病患者更易患艱難梭菌感染[15-17]。國內僅李婷等[7]2013年報道的感染率為28.6 %（8/28）；荀津等[18]報道2011年感染率為10.71 %（6/56），克羅恩病患者艱難梭菌感染的發病率較潰瘍性結腸炎患者高。我院炎癥性腸病患者中艱難梭菌的發病率為13.5 %，與國內外相比處于中間水平，克羅恩病患者的發病率高于潰瘍性結腸炎患者（15.7 %對9.8 %），與荀津等報道的結果相符。相比于李婷等的28例樣本，本組炎癥性腸病的患者較多（222例），且克羅恩病患者比潰瘍性結腸炎患者多，這可能是與其結果不同的原因。

不同地區艱難梭菌的流行克隆也不同。在美國和部分歐洲國家以RT027型艱難梭菌為主[19-20]，在亞洲如日本、韓國、中國等，則以RT017為主[21]。RT027型艱難梭菌在中國少有報道[22]。本研究艱難梭菌主要流行菌株為ST54，且環境中也檢測到ST54。ST54占國內孕婦感染艱難梭菌第二位[23]，該型菌株在智利、日本、印度等地均有檢出[24]，也在斯洛文尼亞的5種動物（豬、狗、貓等）糞便中檢出[25]，說明該型菌株在世界廣泛分布。

在病房廁所中檢測出4株艱難梭菌，3株同時在炎癥性腸病患者糞便中檢出，僅有1株ST185未在患者中檢出。主要流行菌株為ST54。艱難梭菌的傳播途徑為糞-口傳播，且孢子是艱難梭菌長期存在于環境中并造成傳播的重要因素。在病房廁所中檢出，提示艱難梭菌通過糞便排出體外并以孢子形式存在環境中。雖然尚無法判斷患者-環境-患者具體傳播途徑，但應該及時監測病房環境中的艱難梭菌，深入系統的研究，從而預防艱難梭菌的傳播。本次調查只選取了炎癥性腸病患者中艱難梭菌感染的腹瀉病例，很難區分腹瀉是艱難梭菌感染還是患者本身炎癥性腸病活動引起，很多感染的炎性指標（白細胞、C反應蛋白等）在炎癥性腸病活動期也會升高。因此需尋求區分兩者的生物標志物從而為臨床治療提供理論依據。

總之，本院炎癥性腸病患者中艱難梭菌感染發病率較高，以TcdA+TcdB+型的產毒菌株為主。流行的克隆菌株以ST54為主，其他型別散在分布。應及時監測炎癥性腸病患者中艱難梭菌的感染。

[1] RUPNIK M， WILOX MH， GERDING DN. Clostridium diffi cile infection： new developments in epidemiology and pathogenesis [J]. Nat Rev Microbiol， 2009 （7）：526-536.

[2] WANG YF， OUYANG Q， HU RW. Progression of infl ammatory bowel disease in China[J]. J Dig Dis， 2010， 11（2）：76-82.

[3] TRIFAN A， STANCIU C， STOICA O， et al. Impact of Clostridium difficile infection on inflammatory bowel disease outcome： a review[J]. World J Gastroenterol， 2014， 20（33）：11736-11742.

[4] RICCIARDI R， OGILVIE JW JR， ROBERTS PL， et al. Epidemiology of Clostridium difficile colitis in hospitalized patients with inflammatory bowel diseases[J]. Dis Colon Rectum， 2009， 52（1）： 40-45.

[5] NGUYEN GC， KAPLAN GG， HARRIS ML， et al. A national survey of the prevalence and impact of Clostridium difficile infection among hospitalized inflammatory bowel disease patients[J]. Am J Gastroenterol， 2008， 103（6）： 1443-1450.

[6] JEN MH， SAXENA S， BOTTLE A， et al. Increased health burden associated with Clostridium diffi cilediarrhoea in patients with infl ammatory bowel disease[J]. Aliment Pharmacol Ther，2011， 33（12）： 1322-1331.

[7] 李婷，王紅玲，夏冰，等. 艱難梭菌在炎癥性腸病圍手術期患者中的感染及其相關危險因素[J]. 中華試驗外科雜志，2013，30（8）：1751-1753.

[8] AXELRAD JE， SHAH BJ. Clostridium difficile infection in inflammatory bowel disease： a nursing-based quality improvement strategy[J]. J Healthc Qual， 2016， 38（5）： 283-289.

[9] 歐陽欽，潘國宗，溫忠慧，等. 對炎癥性腸病診斷治療規范的建議[J]. 中華消化雜志，2001，4（21）：236-239.

[10] STUBBS SL， BRAZIER JS， O’NEILL GL， et al. PCR targeted to the 16-23 SrRNA gene intergenic spacer region of clostridium diffi cile and construction of a liabrary consisting of 116 different PCR ribotypes[J]. J Clin Microbiol， 1999， 37（2）：461-463.

[11] STABLER RA， DAWSON LF， VALIENTE E， et al. Macro and micro diversity of clostridium diffi cile isolates from diverse sources and geographical location[J]. PLoS One， 2012， 7（3）：e31559.

[12] Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria[S]. 8th ed. approved standard M11-A8. Wayne， PA： CLSI， 2012.

[13] BOSSUYT P， VERHAEGEN J， VAN ASSCHE G， et al. Increasing incidence of Clostridium diffi cile-associated diarrhea in infl ammatory bowel disease[J]. J Crohns Colitis， 2009， 3（1）：4-7.

[14] KIM JH， MUDER RR. Clostridium diffi cile enteritis： a review and pooled analysis of the cases[J]. Anaerobe， 2011， 17（2）：52-55.

[15] RODEMANN JF， DUBBERKE ER， RESKE KA， et al. Incidence of Clostridium difficile infection in inflammatory bowel disease[J]. Clin Gastroenterol Hepatol， 2007， 5（3）：339-344.

[16] KANEKO T， MATSUDA R， TAGURI M， et al. Clostridium difficile infection in patients with ulcerative colitis：investigations of risk factors and effi cacy of antibiotics for steroid refractory patients[J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol， 2011， 35（4）： 315-320.

[17] KOCHHAR R， AYYAGARI A， GOENKA MK， et al. Role of infectious agents in exacerbations of ulcerative colitis in India. A study of Clostridium diffi cile[J]. J Clin Gastroenterol， 1993， 16（1）： 26-30.

[18] 荀津，夏冰，彭謀，等. 炎癥性腸病與艱難梭菌感染的相關性[J]. 武漢大學學報（ 醫學版），2012，33（5）：680-683.

[19] HE M， MIYAJIMA F， ROBERTS P， et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium diffi cile[J]. Nat Genet， 2013， 45（1）： 109-113.

[20] RILEY TV， THEAN S， HOOL G， et al. First Australian isolation of epidemic Clostridium diffi cile PCR ribotype 027[J]. Med J Aust， 2009， 190（12）： 706-708.

[21] PUTSATHIT P， KIRATISIN P， NGAMWONGSATIT P， et al. Clostridium difficile infection in Thailand[J]. Int J Antimicrob Agents， 2015， 45（1）： 1-7.

[22] WANG P， ZHOU Y， WANG Z， et al. Identification of Clostridium difficileribotype 027 for the first time in mainland China[J]. Infect Control Hosp Epidemiol， 2014， 35（1）： 95-98.

[23] YE GY， LI N， CHEN YB， et al. Clostridium diffi cile carriage in healthy pregnant women in China[J]. Anaerobe， 2016， 37： 54-57.

[24] PLAZA-GARRIDO á， BARRA-CARRASCO J， MACIAS JH，et al. Predominance of Clostridium diffi cile ribotypes 012， 027 and 046 in a university hospital in Chile， 2012[J]. Epidemiol Infect， 2016，144（5）： 976.

[25] JANEZIC S， ZIDARIC V， PARDON B， et al. International Clostridium diffi cile animal strain collection and large diversity of animal associated strains[J]. BMC Microbiol， 2014， 14：173.

Molecular epidemiological analysis of Clostridium difficile infection in patients with infl ammatory bowel disease

QIN Juanxiu, MA Xiaowei, DAI Yingxin, WANG Yanan, LIU Qian, LI Min. （Department of Clinical Laboratory, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China）

Objective We evaluated the molecular epidemiology of Clostridium difficile strains in patients with inflammatory bowel disease in our hospital so as to provide evidence for effective surveillance of C. diffi cile infection. Methods From June 2014 to June 2015, a total of 222 stool samples were collected from inpatients with infl ammatory bowel disease and sent to clinical microbiological lab to test C. diffi cile by VIDAS fl uorescence enzyme immunoassay and culture. We analyzed the clonal relatedness of bacterial strains by multilocus sequence typing (MLST), antimicrobial resistance pattern by agar dilution method and prevalence of toxin genes by conventional PCR. Simultaneously, we also examined the environment of the ward where the patients stayed.

Results The C. diffi cile was identifi ed in 30 (13.5%) of the 222 patients. The incidence of C. diffi cile infection (CDI) was 15.7% (22/140) in patients with Crohn’s disease and 9.8% (8/82) in patients with ulcerative colitis. Four strains of C. diffi cile were isolated from the ward environment. All the 22 clinical strains from stool samples were typed into 14 STs by MLST analysis. The most common type was ST54 (5 strains). Most (72.7%) of the 22 strains belonged to toxin A+B+. However, no isolates contained binary toxin genes. Of the C. difficile strains evaluated, 63.6% displayed resistance to clindamycin and eight strains were resistant to moxifl oxacin. All the strains were susceptible to the other six drugs, i.e., chloramphenicol, tetracycline, ampicillin, metronidazole, vancomycin and meropenem. Conclusions Strains with toxin A+B+ were the most common C. diffi cile isolates. ST54 was the most predominant STs in patients with infl ammatory bowel disease in our hospital. It’s necessary to focus on the surveillance of C. diffi cile infection in patients with infl ammatory bowel disease.

Clostridium difficile; inflammatory bowel disease; antimicrobial susceptibility testing; multilocus sequence typing; virulence factor

R378.8

A

1009-7708 ( 2016 ) 06-0761-06

10.16718/j.1009-7708.2016.06.015

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科,上海 200127。

秦娟秀（1989—），女，碩士研究生，初級檢驗師，主要從事病原微生物的致病機制研究。

李敏，E-mail: ruth-limin@126.com。

2015-12-29

2016-03-06