基于牛分枝桿菌PPD的獼猴全血IFN-γ釋放試驗觀察

閔凡貴，郭 羽，羅 挺，潘金春，劉助紅，黃樹武，張 鈺

(1. 廣東省實驗動物監測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣東廣州 510663；2. 北京天壇生物制品股份有限公司，北京 100176)

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基于牛分枝桿菌PPD的獼猴全血IFN-γ釋放試驗觀察

閔凡貴1，郭 羽2，羅 挺1，潘金春1，劉助紅1，黃樹武1，張 鈺1

(1. 廣東省實驗動物監測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣東廣州 510663；2. 北京天壇生物制品股份有限公司，北京 100176)

目的 分析全血IFN-γ釋放試驗在獼猴分枝桿菌檢測中的應用價值。方法 首先測定結核菌素試驗(TST)陽性、陰性獼猴血清樣本的基礎IFN-γ含量。然后以PBS為對照，200 IU bovine-PPD為刺激抗原，分別與TST陰性和陽性獼猴肝素抗凝血共培養約24 h，收集血漿，測定IFN-γ含量。通過分析抗原刺激前后血漿IFN-γ含量變化和刺激指數探討全血IFN-γ釋放試驗的診斷效能。結果 TST陽性獼猴血清基礎IFN-γ含量明顯高于TST陰性獼猴，但離散度都較大。PPD刺激前后，TST陰性獼猴血漿IFN-γ含量無明顯變化，而TST陽性獼猴血漿IFN-γ含量明顯升高(P<0.01)。刺激指數結果顯示，TST陽性獼猴明顯高于TST陰性猴(P<0.01)。ROC曲線分析表明，血漿IFN-γ含量和刺激指數均可作為全血IFN-γ釋放試驗的評價指標。結論 本研究基于小樣本量的實驗結果證實，全血IFN-γ釋放試驗是獼猴分枝桿菌快速診斷的有益補充方法。

獼猴，全血IFN-γ釋放試驗，PPD，分枝桿菌

獼猴是目前用量最大的實驗非人靈長類動物，已實現了人工規模化和標準化的生產繁育。然而，獼猴的生產繁育卻長期遭受到多種病原的威脅，其中，分枝桿菌病對獼猴飼養的影響巨大，以結核分枝桿菌病最為嚴重，由于其病原具有強烈的人獸共患性，并且群內傳播和種間傳播速度快，傳播途徑多樣，控制其傳播顯得尤為重要，而早期篩查與及時隔離感染猴為當前最有效的控制手段[1]。

目前，實驗猴結核診斷的金標方法是結核菌素試驗(tuberculin skin test，TST)，其次是病原學診斷，病理學(活體病理學)診斷應用相對較少。血清學診斷和分子生物學診斷方法也被用于獼猴結核診斷中，但多數仍處于研究階段[2-4]。鑒于目前常用的診斷方法缺乏足夠的準確性以及不能實現快速診斷，本研究將探討全血IFN-γ釋放試驗的可行性。全血IFN-γ釋放試驗是基于外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)對分支桿菌抗原刺激的記憶功能而實現的，體外抗原刺激活化的PBMC可誘導產生IFN-γ，通過測定血漿IFN-γ的增量來初步判斷機體是否感染病原。在醫學領域，全血IFN-γ釋放試驗被證實具有快速、簡便等特點，降低了成本要求，成為較好的輔助診斷方法。如能將該技術充分用于實驗猴的檢測中，則有望大大提高結核病的診斷效能。

1 材料和方法

1.1 血清

近年來，在日常檢疫和監督檢測中收集到TST陽性獼猴血清30份，TST陰性獼猴血清70份。上述血清用于測定基礎 IFN-γ含量。

1.2 抗凝血

廣東某獼猴飼養場曾多次檢出TST陽性病例，本研究收集到14例陽性獼猴肝素抗凝血，參照此前建立的方法進一步測定了PPD抗體[5-6]，結果全部為陽性(A450值為1.62±0.70，cutoff值為0.217)。 在其他獼猴飼養場采集TST陰性且PPD抗體陰性獼猴的肝素抗凝血37頭份。上述抗凝血用于全血IFN-γ釋放試驗。

1.3 抗原

Bovituber-PPD，2 mL/瓶，源于Synbiotics Corp.，批號： Lot 142574。

1.4 全血PPD刺激培養

取24 h內的抗凝血2 mL，分別加入24孔細胞培養板孔內，1 mL/孔，每個樣本2孔，然后依次加入0.1 mL PBS和0.1 mL PPD(200 IU)，置37℃、5% CO2培養箱孵育過夜，約24 h，收集血漿300 μL以上，-20℃保存。

1.5 血漿IFN-γ含量測定

通過流式細胞儀，采用luminex?液相芯片技術測定血漿中 IFN-γ含量，檢測試劑盒源于默克密理博(Merck Millipore)。

1.6 統計學方法

測得的數據用Excel和SAS 8.01軟件進行統計分析，分析方法包括隨機、成對Student′sttest和ROC曲線分析等。

2 結果

2.1 血清基礎IFN-γ含量

分別測定TST陰性和陽性獼猴血清樣本的IFN-γ含量，檢測結果見圖1，分別為： 3.08±5.67 pg/mL(n=70，CV=184%)和31.88±85.46 pg/mL(n=30，CV=268%)。與TST陰性獼猴比較，TST陽性獼猴血清IFN-γ水平顯著升高(unpairedt-test，P<0.01)。

圖1 TST陽性和陰性實驗猴血清IFN-γ含量Fig.1 Basic serum IFN-γ concentrations of TST-positive and -negative macaques

2.2 體外抗原刺激全血誘導IFN-γ產生情況

圖2 PPD刺激前后血漿IFN-γ含量變化Fig.2 Changes in plasma IFN-γ pre- and post-stimulation by PPD

圖3 PPD全血IFN-γ釋放試驗的刺激指數Fig.3 Stimulation indexes of PPD-based whole blood IFN-γ assay

以等體積PBS為陰性對照，分析PPD體外刺激全血誘導IFN-γ產生的情況，結果見圖2。對于TST陰性獼猴，PPD刺激全血不會誘導PBMC產生IFN-γ，血漿IFN-γ含量不會顯著升高(pairedt-test，P>0.05)；而對于TST陽性獼猴，PPD能顯著刺激PBMC產生IFN-γ，血漿IFN-γ含量顯著升高(pairedt-test，P<0.01)。

圖4 ROC曲線分析Fig.4 Results of ROC curves analysis

2.3 刺激指數

鑒于TST陰性獼猴基礎血清IFN-γ含量分布離散度較大，通過分析抗原刺激后的絕對IFN-γ含量來判定感染狀態存在一定的風險。本研究進一步探討了全血IFN-γ釋放試驗的刺激指數(stimulation index，SI)，即抗原刺激后和刺激前(PBS對照)血漿IFN-γ含量的比值。對TST陰性和陽性獼猴SI進行比較，結果顯示，TST陽性獼猴SI明顯高于TST陰性獼猴(unpairedt-test，P<0.01)。

2.4 ROC曲線分析

對TST陰性和陽性獼猴PPD刺激后血漿IFN-γ含量做ROC曲線分析，以陽性似然比最大時對應的IFN-γ含量為cutoff值，結果顯示，最佳cutoff值為10.19 pg/mL，敏感性為100%，特異性為97.3%，ROC曲線下面積為0.9981(圖4, A)。同樣，對TST陰性和陽性獼猴的刺激指數做ROC曲線分析，顯示最佳cutoff值為2.230，敏感性為100%，特異性為97.3%，ROC曲線下面積為1.0(圖4, B)。以上述兩種cutoff值判定，本研究選擇的TST陽性獼猴均為分支桿菌感染。

3 討論

IFN-γ體外釋放試驗包括全血IFN-γ釋放試驗和ELISPOT，與TST相比，具有敏感性和特異性高，不受TST操作上的主觀因素的影響，結果更為客觀可靠，檢測快速，并且單次TST對IFN-γ檢測對結果影響不大等優點，且該方法只需接觸動物一次，有效減少了對動物的應激，具有很大的優越性；因此，IFN-γ體外釋放實驗被認為是TST理想的補充方法[7]。全血IFN-γ釋放試驗相比ELISPOT，進一步優化了試驗程序，不需要分離PBMC，并且降低了對儀器和試劑的需求。

在結核病人全血IFN-γ檢測方面已有商品化試劑盒(QuantiFERON-TB Gold)，并得到了美國FDA和歐盟CE Mark的雙重認可；在牛方面，澳大利亞于1989年率先推出商品化檢測試劑盒(BovigamTM)，此后被澳大利亞政府確認為根除牛結核計劃的普檢方法。盡管全血IFN-γ釋放試驗在人和牛結核檢測中應用廣泛，但是，其敏感性和特異性穩定性差，相關Meta分析的合并敏感性(低于80%)和特異性(低于75%)僅為中等水平[8-10]，尚不能替代TST成為結核診斷的金標準，可以成為TST的有益補充。全血IFN-γ釋放試驗在非人靈長類動物結核診斷方面應用不多，主要原因在于試劑盒用量小，而且非人靈長類動物IFN-γ與人和牛IFN-γ不同，具有種屬特異性，導致試劑盒成本增高。國外現有的少量研究和病例報道顯示，全血IFN-γ釋放試驗在診斷非人靈長類分枝桿菌感染方面具有較高的效能[11-13]；目前，國內僅有的1項初步應用報道只顯示出中等的敏感性[14]。由此可見，全血IFN-γ釋放試驗在獼猴中的應用仍需進一步驗證。我國是獼猴生產繁育大國，開展這方面研究具有重要的現實意義。

本研究首先分析了獼猴的血清基礎IFN-γ水平，盡管TST陽性獼猴血清基礎IFN-γ水平升高，但是離散度大，不足以成為診斷分枝桿菌感染的依據。然后，分析了PPD體外刺激對獼猴PBMC誘導產生IFN-γ的情況，結果表明，PPD刺激TST陰性獼猴不會誘導PBMC產生IFN-γ，血漿IFN-γ含量刺激前后無顯著性變化；PPD刺激則可以誘導TST陽性獼猴PBMC產生大量的IFN-γ，導致血漿IFN-γ含量顯著高于刺激前的測定值。進一步分析顯示，PPD刺激后的IFN-γ絕對含量和SI均可作為判定分枝桿菌感染的依據，其中SI的準確性稍高(ROC曲線下面積比較)。本研究結果初步證實，全血IFN-γ釋放試驗是適于獼猴分枝桿菌感染診斷的有效補充手段，可以彌補TST的不足。

在刺激抗原用量方面，國外文獻多數未提供PPD濃度，國內報道的PPD終濃度基本不超過20 μg/mL[15-16]。影響全血IFN-γ釋放試驗的因素很多，除了動物個體差異外，還包括PPD來源、用量、批次和生產廠家等[16]。本研究選擇了Synbiotics Corp.生產的牛分枝桿菌PPD，純度很高，預實驗結果顯示200 IU/孔和400 IU/孔無顯著性差異，故選擇200 IU/孔開展實驗，相比國產PPD用量偏低。

本研究基于小樣本量取得了較理想的實驗結果，但仍處于初級研究階段，尚需要大量臨床樣本來驗證該方法的敏感性與特異性，尤其是TST檢測假陰性樣本的驗證。

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Performance of bovine-PPD based whole blood IFN-γ assay for rhesus macaques

MIN Fan-gui1, GUO Yu2, LUO Ting1, PAN Jin-chun1, LIU Zhu-hong1, HUANG Shu-wu1, ZHANG Yu1

(1. Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663, China； 2. Beijing Tiantan Biological Product Co. Ltd., Beijing 100176)

Objective To assess the potential of whole blood IFN-γ assay for diagnosing mycobacterium in rhesus macaques. Methods Firstly, basic serum IFN-γ concentrations of TST-negative and -positive rhesus macaques were detected. Then, heparinized whole blood from TST-negative and -positive rhesus macaques was incubated with PBS and 200 IU bovine-PPD (tuberculin purified protein derivative) for about 24 h, respectively. The supernatant plasma were harvested and used to determine the concentrations of IFN-γ. The results of plasma IFN-γ concentrations and stimulation index (SI) were used to analyze the diagnostic potential of the whole blood IFN-γ assay. Results The basic serum concentrations of IFN-γ for the TST-positive monkeys were significantly higher than that of the TST-negative macaques, showing a high coefficient of variation. There was no significant effect on the production of IFN-γ in the TST-negative macaques. While significantly elevation of IFN-γ concentrations was found in stimulated plasma of TST-positive macaques (P<0.01). The SI of TST-positive macaques was significantly higher than the TST-negative ones. ROC curve analysis revealed that IFN-γ concentrations and SI could be used as evaluation index of whole blood IFN-γ assay. Conclusions Based on a small sample experiment we have demonstrated that whole blood IFN-γ assay may be one possible auxiliary diagnostic method for tuberculin skin test.

Rhesus macaques；Whole blood IFN-γ assay；Tuberculin purified protein derivative, PPD；Mycobacterium; Diagnosis

廣東省科技計劃項目(2013B020307005；2015A030302029;2016A030303023)；國家科技支撐計劃(2013BAK11B01)。

閔凡貴(1980 - )，男，副研究員，碩士，研究方向： 實驗動物與比較醫學研究。

張鈺(1970 - )，女，研究員，E-mail: zhangyugzh@hotmail.com。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0005-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.10.002

2016-03-19