谷氨酰胺聯合臍血間充質干細胞移植在大鼠腸缺血再灌注損傷中的作用

王炳杰，胡延偉，趙葉芳，張仕東

(河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院 肛腸外科1， 普外科2、4，婦產科3，邢臺 054001)

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谷氨酰胺聯合臍血間充質干細胞移植在大鼠腸缺血再灌注損傷中的作用

王炳杰1，胡延偉2，趙葉芳3，張仕東4

(河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院 肛腸外科1， 普外科2、4，婦產科3，邢臺 054001)

目的 探討谷氨酰胺聯合臍血間充質干細胞(MSCs)移植在大鼠腸缺血再灌注損傷中作用。方法 體外復蘇并培養臍血間充質干細胞移植前備用，觀察CM-DiI熒光標記后臍血間充質干細胞的去向。80只SD大鼠隨機分為正常對照組，缺血再灌注損傷組，谷氨酰胺組，MSCs移植組及聯合組每組各15只。對照組采用生理鹽水灌腸，損傷組采用TNB (S乙醇稀釋)灌腸，在TNBS建模后1 h，谷氨酰胺組于尾靜脈輸入谷氨酰胺0.45 g/kg、MSCs移植組于尾靜脈輸入1 × 1010/L臍血間充質干細胞懸液，聯合組尾靜脈輸入谷氨酰胺0 .45 g/kg + 臍血間充質干細胞懸液1 × 1010/L。通過ELISA法檢測各組大鼠血清中腸脂肪酸結合蛋白(IFABP)、白介素-6(IL-6)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量；各組于再灌注1 h、3 h后檢測腸組織含水率；通過RT-PCR、Western blot觀察大鼠腸黏膜上皮細胞caspase-3、NF-kB、Bcl-2在谷氨酰胺聯合MSCs移植后的mRNA和蛋白的表達情況。結果 通過熒光示蹤法觀察到移植的MSCs細胞分布于腸粘膜淋巴組織內和腺上皮細胞間，表明MSCs可能參與了腸缺血再灌注損傷的修復過程。各組大鼠血清中SOD、IFABP、IL-6的含量變化比較，損傷組血清中IFABP、IL-6的含量較對照組顯著增加，而谷氨酰胺組，MSCs移植組及聯合組與之比較，則顯著減少，聯合組減少更為明顯，損傷組血清中SOD的含量較對照組顯著減少，而谷氨酰胺組，MSCs移植組及聯合組與之比較，則顯著增高，聯合組增高更為明顯(P<0.05)。再灌注1 h和3 h，損傷組腸組織含水率均明顯高于對照組；與損傷組相比，谷氨酰胺組、MSCs移植組及聯合組腸組織含水率值均顯著降低，聯合組降低更為明顯，而谷氨酰胺組、MSCs移植組差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，損傷組腸黏膜上皮細胞caspase-3、NF-kB的mRNA和蛋白表達明顯上調，Bcl-2的mRNA和蛋白表達明顯下調(P<0.05)，而谷氨酰胺組、MSCs移植組及聯合組與之比較，caspase-3、NF-kB的mRNA和蛋白表達明顯下調，Bcl-2的mRNA和蛋白表達明顯上調(P<0.05)，谷氨酰胺組及MSCs移植組之間無統計學差異(P>0.05)，但兩組與聯合組比較，差異明顯(P<0.05)。結論 谷氨酰胺組及MSCs移植后，明顯減輕了大鼠腸缺血再灌注損傷程度，其可能通過抑制caspase-3、NF-kB表達和促進Bcl-2表達減輕腸黏膜缺血再灌注損傷。

臍血間充質干細胞；谷氨酰胺；移植；大鼠；腸道損傷

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IR)是多種原因誘發的器官缺血時引起原有結構破壞，當恢復血液供應時細胞和組織結構遭到損傷并出現功能障礙，使損傷加重的現象[1，2]。小腸是IR最常累及的器官，在臨床上是無法避免的病理生理過程，腸系膜動脈取栓術后、溶栓術后、出血性休克、小腸移植術后常會繼發性發生，有很高的死亡率，且預后很差[3]。腸IR與其他器官的IR損傷不同，其不僅有氧自由基的生成、免疫細胞應答、炎癥因子釋放的過程[4]，還有缺血缺氧所致的內皮細胞和上皮細胞屏障功能受破壞，進而引起細菌移位，導致全身性的免疫應答和多器官功能障礙[5，6]。

谷氨酰胺(glutamine, Gln)對腸上皮細胞正常作用的發揮起重要作用，是抗氧化防御系統中重要物質谷胱甘肽和核苷酸等合成的前體，在抗氧化應激中對機體起到保護作用[7]。既往研究表明，Gln能夠減輕IR損傷，起到保護性作用[8]。

IR損傷目前還沒有確切的治療手段，國際研究熱點集中在干細胞移植治療[9]。干細胞有臍血和骨髓兩種來源[10]，因自體移植需抽取自體骨髓來進行分離以及培養周期較長，并且得到的數目較少，活性不高，定向遷移以及促進再生的能力均下降，且病人及家屬較難接受，所以臨床實施有一定的困難[11]。臍血間充質干細胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells, HUMSCs)從臍血中分離得到，相比于祖細胞更加原始，增殖分化能力更強，無論是在體內還是體外均能多方向分化[12]，是目前在腦損傷、腸IR損傷等多種疾病在內的治療中常用的理想細胞[13-14]。HUMSCs免疫原性極低，一般情況下不會引起免疫反應或者是移植物抗宿主病，因此受到臨床工作者的青睞，有望成為理想的取材細胞。本研究聯合應用Gln和HUMSCs，觀察其對IR的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗于2013年3月～2015年10月在河北醫科大學動物實驗中心完成，實驗動物使用許可證號：【SYXK(冀)2011-0005】。80只SD大鼠，體質量220～250 g，由河北醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號：【SCXK(冀)2011-0004】。實驗中對動物的處置符合動物倫理學要求。CM-DiI(美國Invitrogen公司)；谷氨酰胺粉末，純度99%(美國 Sigma 公司)；細胞裂解液和BCA法定量試劑(碧云天生物技術公司)；PVDF膜(Millipore公司)；anti-NF-kB antibody(Santa Cruz公司)；anti-β-actin(福州中彬金橋公司)；IFABP檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；總RNA提取試劑TRIzol(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；Soniprep150型超聲波發生器(上海寧商超聲儀有限公司)；酶聯免疫試劑盒(上海恒遠生化試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外復蘇并培養臍血間充質干細胞：將凍存管從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解凍，注意避免凍存管頂部沾水而受污染。將細胞加入有培養基的離心管中，1 500 r/min 離心5 min，去掉上清液，接種到新的培養基皿中，置入體積分數為0.05 的CO2培養箱內培養。每3 d半量換液1次，7～10 d傳代 1 次。繼續觀察，待貼壁細胞融合完全后對其進行消化并進行傳代，將第2代的細胞分別接種到2個6孔板上，調整細胞密度使其滿足1×105孔，當再次融合達80%時，向其中添加誘導劑。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.2.2 大鼠建模及其實驗分組： 參加實驗80只，進入結果分析75只，中途死亡及其脫落5只。將其75只SD大鼠隨機分為正常對照組，缺血再灌注損傷組，谷氨酰胺組，MSCs移植組及聯合組每組各15只。對照組采用生理鹽水灌腸，損傷組采用TNB (S乙醇稀釋)灌腸，在TNBS建模后1h，谷氨酰胺組于尾靜脈輸入谷氨酰胺0.45 g/kg、MSCs移植組于尾靜脈輸入1×1010/L 臍血間充質干細胞懸液，聯合組尾靜脈輸入谷氨酰胺0 .45 g/kg+臍血間充質干細胞懸液1×1010/L。

1.2.3 臍血間充質干細胞示蹤：利用CM-DiI與HUMSCs結合而將其標記，使其在顯微鏡下觀察時能夠表現出紅色的熒光而進行跟蹤。將等量的CM-DiI與DMSO進行混合并充分溶解后制成原液，隨后從中抽取2 μL放到干凈的Ep管中，添加DPBS液1 mL制成2 μg/mL的工作液。向上述已制備好的HUMSCs中添加PBS進行濃度的調整，使其滿足1 mg/mL，并從中抽取50 μL添加到干凈的Ep管中，向其中添加等量的上述配好的工作液，放在培養箱中溫育5 min，隨后將其放在4℃條件下靜置15 min，畢后用PBS進行沖洗。將其放在離心機中，調整參數進行離心，2 h后將其取出丟棄上層液體，用槍頭對下層留下的沉淀進行反復吹打，隨后將其進行接種及培養。并從中取出少量的細胞行細胞爬片，監測細胞的變化，6 h后將其置于熒光顯微鏡下對CM-DiI標記的HUMSCs的進行觀察，對結果進行拍照。4周后將大鼠處死，同時取腸組織立即以OCT包埋，冰凍切片，直接熒光顯微鏡下觀察，記錄和分析CM-DiI熒光分布情況。

1.2.4 ELISA法檢測IFABP、IL-6、SOD的含量： 將大鼠麻醉后處死，截取腸管約1 000 mg，將腸系膜以及內含物分離，用生理鹽水對其進行沖洗，隨后放在-80℃條件下進行保存。在4℃條件下將300 mg的腸組織用生理鹽水進行沖洗，隨后用濾紙將其表面的水分吸干，將9倍于組織塊的生理鹽水視為勻漿介質。調整Soniprep150超聲波發生器的參數為振幅14 μm，時間30 s，使細胞充分破裂。將組織勻漿中的10%放在低溫離心機中，調整其參數，進行離心，將上清液取出并保留。采用ELISA方法測定血清中IFABP、IL-6、SOD的含量。

1.2.5 各組于再灌注1 h、3 h后檢測腸組織含水率： 將大鼠處死后進行消毒并剖開腹部取回盲瓣以上腸管3 cm，將其內的內容物以及附于表面的腸系膜丟棄，用生理鹽水進行反復沖洗。用吸水紙將附于表面的水分吸取干凈，隨后將其放在電子分析天平上稱量其濕重(W)，將其放在80℃的恒溫干燥箱中進行烘干，對其進行反復稱重直至重量不再變化，再次進行稱重，得到干重(D)，根據公式[(W - D)/W] × 100%，計算含水率。

1.2.6 通過RT-PCRt檢測caspase-3、NF-kB、Bcl-2 mRNA的表達：對總RNA進行提取并轉錄。β-actin 上游引物:5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，下游引物:5’-TCAGGAGGAGCAATGATCT TG-3’；Casepase-3上游引物：5’-AGATACCGGTGGAGG CTGACT-3’，下游引物：5’-TCTTTCGTGAGCATGG ACACA-3’； NF-kB的上游引物：5’-GCATTCTGAC CTTGCCTATC-3’,下游引物：5’-ATCCTTCCCAAA CTCCACC-3’；Bcl-2 上游引物:5’-CGCTGGGAG AACAGGGTA-3′，下游引物:5’-GGGCTGGGAGG AGAAGAT-3′。加入SYBR Green RCR Master Mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 1μL，DEPC H2O 8.2 μL，將上述物質進行混合，隨后進行離心，行PCR反應。畢后行溶解曲線分析，根據結果來確定該反應是否特異。應用軟件分析得到的結果。

圖1A：首次換液后可見部分細胞已貼壁；圖1B：第3代MSCs細胞； 圖1C：第6代MSCs細胞圖1 MSCs細胞的形態觀察(×100)Fig. 1A. After the first change of medium, some cells were adherent to the glass surface. Fig. 1B: The 3rd generation of MSCs cells; Figure 1C: The 6th generation of MSCs cellsFig.1 Morphological observation of the MSCs

1.2.7 Western blot檢測caspase-3、NF-kB、Bcl-2 蛋白的表達：將大鼠麻醉后，迅速取出包含損傷區域在內的腸組織約10 mm，對其中的總蛋白參照說明書進行提取，隨后對蛋白樣品濃度進行檢測。清洗玻璃板，進行灌膠上樣，并進行電泳，將蛋白采用印跡法取 50 μg 總蛋白于 10% 聚丙烯酰胺凝膠中電泳。取纖維膜用半干式電印跡將蛋白進行轉膜，37℃溫育2 h，加入一抗后過夜，次日洗膜后加入HRP標記的二抗，重復進行上述溫育及洗膜處理，用顯色劑進行顯色。重復以上操作步驟3次。用Quantity One 處理系統進行結果的處理。

2 結果

2.1 MSCs細胞的形態觀察

剛接種完畢后對細胞形態進行觀察發現其形態不一，差異性較大。進行首次換液后將未貼壁的細胞及雜質去除后可見到部分細胞已貼壁，但形態仍不規則(圖1A)。4 d后再次換液可見有小的細胞集落形成，7 d后再次觀察可見集落明顯增大，并且呈方向性排列，10～12 d后細胞融合度良好，可以進行傳代。傳代后生長速度明顯增快，且形態逐漸趨于一致。第3代時細胞胞質色變淺，核較清晰，胞體以紡錘形和梭形為主，周圍可見數量不等的突起，突起間相互交織，細胞排列較紊亂，極性不明顯(圖1B)。至第6代時，細胞的形態比較無明顯變化，但胞體變長變大，形態更加均一，呈方向性排列，極性較一致(圖1C)。

2.2 CM-Dil標記的HUMSCs形態觀察

HUMSCs能否于腸IR損傷中發揮作用的前提是其能否有效的表達于腸組織中，為了對其進行證明，我們用活細胞染色劑CM-DiI對其進行染色。將活細胞染色劑CM-DiI與HUMSCs共同放置6h后利用熒光顯微鏡進行觀察發現，經CM-DiI標記后的HUMSCs細胞均發出紅色熒光(圖2A)。將CM-DiI標記的HUMSCs細胞經尾靜脈移植入腸IR大鼠后，用熒光顯微鏡在大鼠腸粘膜的淋巴以及上皮細胞的冰凍切片中可以見到大量的HUMSCs分布，且向損傷區遷移(圖2B)，提示其可能參與腸IR損傷的修復過程。

2.3 ELISA法檢測IFABP、IL-6、SOD的含量

對各組中IFABP、IL-6以及SOD含量進行比較發現，損傷組血清中IFABP以及IL-6的含量較對照組明顯增加，而谷氨酰胺組、MSCs移植組以及聯合組兩者的含量則明顯減少，且聯合組減少更為顯著(P<0.05)；對各組中SOD含量進行比較發現，損傷組較對照組明顯減少，而其他三組較其則顯著增高，且聯合組增高更顯著(P<0.05)。見表1。2.4 再灌注1 h、3 h后腸組織含水率的檢測結果

Tab.1 The changes of supernatant IFABP, IL-6, and SOD in the intestinal tissue of various groups

組別Groups人腸脂肪酸結合蛋白(IFABP)(ng/L)白介素-6(IL-6)(ng/L)超氧化物歧化酶(SOD)(ng/L)對照組Control1223.04±76.54a1380.48±131.32a134.09±27.05a損傷組Injury1302.23±136.13b1535.68±104.56b116.88±25.93b谷氨酰胺組Glutamine1033.04±126.24c976.57±114.60c234.66±24.12cMSCs組MSCs1016.17±105.13d957.83±105.06d249.58±23.20d聯合組Combination636.78±35.40305.98±29.69420.53±23.20

注：abcdP<0.05。 Note.abcdP<0.05.

Tab.2 Comparison of the water content in the intestinal tissue of the groups

組別Groups腸組織含水率(%)Watercontentintheintestinaltissue1h3h對照組Control41.52±2.18a45.41±2.24a損傷組Injury84.46±2.66b89.26±2.08b谷氨酰胺組Glutamone64.94±2.11c62.53±2.80cMSCs組MSCs64.68±2.20d62.42±2.67d聯合組Combination43.42±2.5645.13±2.23

注：abcdP<0.05。Note.abcdP<0.05。

IR損傷后不同時間點對各組含水率進行比較：損傷組中腸組織的含水率較對照組明顯升高，且顯著高于其他三組，與聯合組相比差異最為顯著(均P<0.05)；而谷氨酰胺與MSCs組進行比較無意義(P>0.05)。見表2。

2.5 Caspase-3、NF-kB、Bcl-2 mRNA的表達

經PT-PCR對各組mRNA進行測定可知，與對照組相比，損傷組的腸粘膜上皮細胞中caspase-3及NF-kB的mRNA表達量顯著上調，而Bcl-2的mRNA的表達量明顯下調(P<0.05)；而谷氨酰胺、MSCs以及聯合組與之相比較，caspase-3、NF-kB明顯下調，Bcl-2明顯上調，各組間差異有統計學意義 (P<0.05)。如圖3。

2.6 Caspase-3、NF-kB、Bcl-2 蛋白的表達

對蛋白的表達情況進行測定發現，損傷組中caspase-3的表達量較對照組顯著上調，Bcl-2的表達量明顯下調(P<0.05)；而谷氨酰胺、MSCs以及聯合組與之相比較，caspase-3明顯下調，Bcl-2明顯上調，差異有統計學意義(P<0.05)(圖4)。對各組間總NF-kB進行比較，差異無統計學意義，進一步對各組磷酸化的NF-kB表達水平進行比較，得到與casepase-3一致的結果，即損傷組中磷酸化的NF-kB表達量較對照組顯著上調；而谷氨酰胺、MSCs以及聯合組與之相比較，磷酸化的NF-kB明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖2A：腸粘膜淋巴組織CM-Dil標記的MSCs；圖2B：上皮細胞CM-Dil標記的MSCs圖2 CM-DiI標記的MSCs(×200)Fig. 2A: CM-Dil-labeled MSCs in the intestinal lymphoid tissue; Fig. 2B: The epithelial cell CM-Dil-labeled MSCsFig.2 The CM-DiI labeled MSCs

圖3 各組Caspase-3、NF-kB、Bcl-2 mRNA表達Fig.3 Expression of caspase-3, NF-kB, and Bcl-2 mRNA in each group

圖4 各組caspase-3、NF-kB、Bcl-2 蛋白表達Fig.4 The expression of caspase-3, NF-kB, and Bcl-2 protein in each group

圖5 各組NF-kB的表達情況Fig.5 The expression of NF-κB in each group

3 討論

大量研究表明，腸道可能是對缺血缺氧最敏感的器官之一，在腸絞窄、腹部外傷及腸系膜血管缺血性疾病等情況下，小腸出現不同程度的缺血性損傷，當恢復血流時，其損傷進一步加重[15-18]。因此，研究IR的機制以及如何對其進行預防有重要意義。牛瓊等[19]研究表明，在IR中Gln能夠保護腸粘膜，但是否和抗氧化應激以及抗炎相關，未見報道。

近年來，人們對腸IR損傷的機制有了更加深入的了解，如氧自由基、促炎細胞介質、黃嘌呤氧化酶的釋放等機制均參與腸IR損傷[20]。小腸絨毛中含有大量的活性氧簇相關的酶，當IR時能夠激活腺嘌呤-次黃嘌呤途徑，增加氧自由基的產生。SOD是氧自由基的去除劑能夠反映機體對其的去除能力。而IL-6被認為是IR的主要致病因子。本研究通過對SOD及IL-6進行檢測發現，機體損傷后SOD表達減少，而IL-6表達增加，與以往研究一致[21]。IFABP亦是腸IR損傷的指標之一。本研究發現，損傷組IFABP表達量明顯增加，與既往[22]的研究結論相同。

細胞凋亡是IR過程中的關鍵一環。通過對腸組織中凋亡相關蛋白進行檢測，能夠反映大鼠IR損傷后腸道的變化情況。其通過激活casepase最終誘導凋亡的發生。Bcl-2是抗凋亡因子中的一員[23，24]。而NF-kB能夠上體炎癥及免疫因子的表達，誘發炎癥反應、細胞凋亡，最終導致臟器的損傷[25]。本研究通過對其進行檢測發現，IR后casepase以及NF-kB表達增加，而Bcl-2減少。

總之，通過本研究發現，大鼠腸IR損傷后進行谷氨酰胺聯合HUMSCs移植，能夠改善損傷，對腸道起到保護性作用。其可能的機制是減少casepase-3、NF-kB并促進Bcl-2表達來實現。

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Effects of glutamine in combination with umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation on intestinal ischemia reperfusion injury in rats

WANG Bing-jie1, HU Yan-wei2, ZHAO Ye-fang3, ZHANG Shi-dong4

(1.Department of Anorectal Surgery, 2,4. Department of General Surgery,3. Department of Obstetrics and Gynecology, Hebei Medical University Xingtai City People’s Hospital, Xingtai Hebei 054001, China)

Objective To investigate the effect of glutamine in combination with umbilical cord blood mesenchymal stem cells (MSCs) transplantation on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Umbilical cord blood mesenchymal stem cells were isolated, and were labeled with CM-DiI fluorescent dye. Eighty Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, ischemia reperfusion injury group, glutamine group, MSCs transplantation group and combined group with 15 rats in each group. The control group received saline enema. The injury group was treated with TNBS (ethanol dilution) enema. The glutamine group at 1 h after TNBS received intravenous injection of 0.45 g/kg glutamine. The rats of MSCs transplantation group had tail vein injection of 1 ×1010/L umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension, and the combined group received intravenous injection of glutamine 0.45 g/kg and 1×1010/L umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension. ELISA was used to detect the midgut fatty acid binding protein (iFABP), interleukin 6 (IL-6), and superoxide dismutase (SOD) content in the rat serum. The water content of intestinal tissue was detected at 1 h and 3 h after reperfusion in each group. The expressions of NF-kB, Bcl-2 and caspase-3 mRNA and proteins in the rat intestinal epithelial cells after treated with glutamine in combination with MSCs were detected by RT-PCR and Western blot assays. Results The fluorescent tracer method revealed that the transplanted MSCs cells were distributed in the intestinal mucosal lymphoid tissues and glandular epithelial cells, indicating that MSCs might be involved in the repair process of intestinal ischemia-reperfusion injury. The content of serum IFABP and IL-6 in the injured group was significantly higher than that in the control group, while significantly reduced in the glutamine group, MSCs transplantation group and combined group, with the most obvious in the combined group. The content of SOD in the injury group was significantly lower than that in the control group, and significantly increased than that in the glutamine group, MSCs transplantation group, with the most striking in the combined group (P<0.05 for all). The water content of intestinal tissue in the injury group at 1 and 3 hours after reperfusion was significantly higher than that in the control group, significantly lower in the glutamine group, MSCs transplantation group and the combined group, with the most decreased in the combination group, and there was no significant difference between the glutamine group and MSCs transplantation group (P>0.05). Compared with the control group, the caspase-3 and NF-kB mRNA and protein expressions in the intestinal mucosal epithelial cells of the injury group were significantly increased, and the expressions of Bcl-2 mRNA and protein were significantly reduced (P<0.05), the expressions of caspase-3 and NF-kB mRNA and protein were significantly reduced in the glutamine group, MSCs transplantation group and combined group. The expressions of Bcl-2 mRNA and protein were significantly increased (P<0.05), while no significant difference was shown between the glutamine group and MSCs transplantation group (P>0.05), but there was a significant difference between these two groups and the combined group (P<0.05). Conclusions After treated with glutamine and MSCs transplantation, the degree of intestinal ischemia reperfusion injury is obviously reduced in rats. It may be mediated through inhibiting the expression of caspase-3 and NF-kB and promoting the expression of Bcl-2.

Umbilical cord blood mesenchymal stem cells; Glutamine; Transplantation; Rat; Intestinal ischemia reperfusion injury; Rat

王炳杰(1978-)，主治醫師，研究方向：普外，肛腸。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0025-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.10.006

2016-06-15