組織塊法分離培養小鼠脾臟間充質干細胞

丁 麗，朱 恒，張海宏，楊 洋，韓冬梅，王志東，鄭曉麗， 董 磊，閆洪敏，劉 靜，朱 玲，薛 梅，郭子寬，王恒湘

(1.中國人民解放軍空軍總醫院血液科，北京 100142；2. 軍事醫學科學院基礎醫學研究所，北京 100850；3. 中國人民解放軍空軍總醫院普外科，北京 100142；4. 軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京 100850)

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組織塊法分離培養小鼠脾臟間充質干細胞

丁 麗1，朱 恒2，張海宏3，楊 洋1，韓冬梅1，王志東1，鄭曉麗1， 董 磊1，閆洪敏1，劉 靜1，朱 玲1，薛 梅1，郭子寬4，王恒湘1

(1.中國人民解放軍空軍總醫院血液科，北京 100142；2. 軍事醫學科學院基礎醫學研究所，北京 100850；3. 中國人民解放軍空軍總醫院普外科，北京 100142；4. 軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京 100850)

目的 通過組織塊培養法，建立一種高效可靠的小鼠脾臟間充質干細胞分離擴增策略。方法 無菌條件下取小鼠脾臟組織充分碾碎，使用膠原酶消化獲得的脾臟基質組織，將消化后的組織塊種于培養瓶中，觀察從組織塊中遷移出的細胞形態，采用流式細胞術分析其表型，并將其做成骨和成脂肪誘導分化。結果 消化后的脾臟組織塊中遷移遷移出大量梭形纖維樣細胞，流式細胞術檢測結果表明，該種細胞高表達CD29、CD44、Sca-1 和CD105，低表達CD11b、CD34、CD45和Ia。多向分化實驗結果表明：小鼠脾臟基質組織中遷移出的細胞具有較好的成脂肪和成骨分化能力。結論 組織塊法可以分離培養出小鼠脾臟間充質干細胞，所獲得的細胞純度高，分化能力強，為開展相關研究提供了良好的細胞模型。

組織；細胞培養；脾臟；間充質干細胞

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)是一種具有多向分化潛能和高度自我更新能力的干細胞[1，2]。MSC最早由Friedenstein等[3]等在骨髓中發現，隨后研究人員陸續在骨、臍帶、脂肪等多種組織中分離成功。MSC在適宜的條件下可以大量擴增，并且分化為成骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、神經細胞等多種組織類型的細胞，是目前組織工程領域最常用的種子細胞之一[1]。此外，MSC還具有造血支持能力，能夠調節造血干細胞分化為多種譜系的造血細胞，是造血微環境的重要組成部分[4]。更有意義的是，MSC還能夠調節多種免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等的發育和功能，有助于維持機體免疫反應和免疫穩態[5]。

脾臟是人和動物體內重要的造血器官和免疫器官[6]。在人和動物的胚胎發育早期，脾臟有造血的功能。出生后脾的造血功能基本消失，但在極端條件下，如機體出現嚴重造血障礙時，脾臟也可重新出現造血功能。此外，某些嚙齒類動物如小鼠的脾臟可以終身造血[6]。脾臟還是重要的免疫器官。脾臟內含有大量的T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)等免疫細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。其中的樹突狀細胞能夠攝取機體內的腫瘤抗原或者外源入侵的抗原，加工遞呈給相應的T細胞，促進相關的T細胞亞群增殖分化，并啟動B細胞為主的體液免疫，實現腫瘤清除和病原清除[7]。

值得關注的是，脾臟內造血細胞和免疫細胞的發育分化過程受到脾臟微環境的調控[8,9]。MSC及由MSC分化而來的成纖維細胞和內皮細胞等不僅為造血細胞和免疫細胞發育分化提供空間結構，而且表達多種調節因子(如細胞因子、膜微粒和一氧化氮等)和細胞間粘附分子，共同構成脾臟微環境，從而發揮調節作用。因此，分離獲得脾臟MSC，深入開展功能研究，對于了解脾臟基質微環境尤為重要。然而，多年以來有關脾臟MSC分離培養的策略一直報道不多[10]。鑒于此，我們在參閱大量文獻的基礎上，探索了膠原酶消化聯合組織塊培養法，以期建立出穩定、重復性好、細胞純度高的小鼠脾臟MSC分離策略，從而為開展脾臟相關的造血和免疫學相關研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康C57BL /6 和BALB /cl 小鼠，6～8周齡，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號[SCXK(京)2012-0001]。

1.2 儀器與試劑

干細胞培養用胎牛血清、α-MEM培養基、高糖DMEM培養基和磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco 公司；β-磷酸甘油、磷酸化維生素C、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤( IBMX)、胰島素、油紅O 染液、II型膠原酶、胰酶、堿性磷酸酶試劑盒購自美國Sigma 公司； MSC 流式表型檢測用抗體: PE-anti-mouse CD11b、PE-anti-mouse CD29、FITC-anti-mouse CD34、PE-anti-mouse CD44、FITC-anti-mouse CD45、PE-anti-mouse CD105、PE-anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)、PE-anti-mouse Ia購自美國Ebioscience 公司；細胞培養板和培養瓶購自美國康寧公司；流式細胞儀購自美國Becton Dickinson 公司；細胞培養箱購自英國Thermo 公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 細胞培養

無菌條件下，打開小鼠腹腔取脾臟，在超凈臺內以注射器柄將其在培養皿中充分碾碎，以PBS沖去細胞成分，將獲得的基質組織加入0.1%的II型膠原酶液中，37℃條件下以消化1 h, 棄消化液，將消化后的脾臟基質組織種入含有10%血清的α-MEM中，3 d 換液，待MSC 爬滿培養瓶后，以胰酶消化，收MSC 分別種入貼附培養瓶和低吸附培養皿中，在倒置顯微鏡下觀察形態，拍照。每隔2～3 d 傳代，收取第3～6 代細胞用于實驗。

1.4 流式細胞分析

參照我們前期發表的方法采用流式細胞術分析小鼠脾臟MSC 的免疫表型[11,12]。簡言之，以胰酶消化收獲第4 代細胞，制備為單細胞懸液，調整細胞數為1 × 106細胞/管。按照說明書要求，分別加入抗小鼠CD11b，CD29，CD34，CD44，CD45，CD105和Sca-1和Ia抗體。4℃避光孵育30 min。洗滌未結合的抗體后，采用美國Becton Dickinson 流式細胞儀上機，實驗數據采用WinMDI 2. 9 軟件分析。

1.5 細胞分化潛能的鑒定

成骨和成脂肪誘導分化實驗參照以往發表的方法進行[11,12]。簡言之，成骨分化以及染色取第4 代小鼠脾臟MSC，按照5 × 104細胞/cm2的細胞密度種于24孔培養板中，誘導體系為高糖DMEM、10%胎牛血清，維生素C 磷酸鹽(50 μmol /L)，β 磷酸甘油(10 mmol /L) 和地塞米松( 10-7mol /L)。7 d 后根據試劑盒說明書要求進行堿性磷酸酶染色。成脂肪分化以及染色收獲第4 代小鼠脾臟MSC，按照3 × 104細胞/cm2的細胞密度種于24孔培養板內，誘導體系為高糖DMEM，IBMX ( 0.5 μmol /L)，10%胎牛血清，胰島素( 10 ng/mL) 和地塞米松( 10- 6mol /L)。成脂肪誘導的第7 天，染油紅O 判斷分化效率。染色結果顯微鏡下觀察，照相。

2 結果

2.1 組織塊法分離獲得的小鼠脾臟MSC具有經典的形態特征

無菌條件下，分離小鼠脾臟，碾碎后得到脾臟基質組織(圖1A)，以膠原酶消化為小組織塊(圖1B)。

將膠原酶消化后的脾臟基質組織在培養基中靜置止培養3～5 d左右，即可在倒置顯微鏡下觀察到有細胞從組織塊中爬出(圖2A)。這些細胞為梭形貼壁生長，經過傳遞培養后，生長迅速，并可呈旋渦狀或者紡錘狀密集生長，符合經典的MSC形態和生長特點(圖2B)。

2.2 組織塊法分離獲得的小鼠脾臟MSC具有經典的細胞免疫表型

為了判斷組織塊法分離獲得的小鼠脾臟MSC的細胞純度，我們進一步檢測了其免疫表型。流式細胞術的檢測結果表明，我們分離獲得的小鼠MSC 高表達間質標記CD29，CD44，高表達干細胞標記Sca-1 和CD105，低表達造血標記CD11b 和CD45，低表達造血干細胞標記CD34，低表達免疫共刺激分子Ia( 圖3)。該結果表明我們獲得的是一群間質來源的非造血干細胞，且具有較低的免疫原性，符合經典的MSC免疫表型特征。

2.3 組織塊法分離獲得的小鼠脾臟MSC具有多譜系分化潛能

為觀察小鼠脾臟MSC的多向分化潛能，我們分別進行了成骨和成脂肪誘導分化實驗。堿性磷酸酶是MSC成骨分化過程中的重要指標。如圖4A所示，在成骨誘導體系中培養的小鼠脾臟MSC堿性磷酸酶染色陽性，提示該種類的MSC具有成骨分化潛能。油紅O具有較好的脂肪結合能力。小鼠脾臟MSC成脂肪誘導7 d后，即可見細胞中逐漸出現大量脂肪滴，加入油紅O 染色液之后，可觀察到脂肪滴被染為紅色，該結果表明小鼠脾臟MSC具有良好的成脂肪分化能力( 圖4B)。

A為未消化的脾臟基質組織，B為膠原酶消化后的脾臟基質組織圖1 分離消化脾臟基質組織(A) Undigested spleen mesenchymal tissues; (B) Collagenase-digested spleen mesenchymal tissuesFig.1 Isolation and digestion of spleen mesenchymal tissues

3 討論

脾臟微環境是調節機體免疫功能、胚胎造血和出生后病理性造血的重要生理結構。但是脾臟微環境研究一直缺乏與體內環境相對應的細胞工具。

(A)間充質干細胞從脾臟基質組織塊中爬出；(B)為增殖良好的脾臟間充質干細胞圖2 原代培養脾臟間充質干細胞(標尺=200 μm)(A) Mesenchymal stem cells migrate from a spleen tissue explant. (B) Highly proliferative spleen mesenchymal stem cells Fig.2 Primary culture of spleen mesenchymal stem cells

圖3 脾臟間充質干細胞的流式免疫表型Fig.3 Immunophenotypes of the spleen mesenchymal stem cells detected by flow cytometry

(A)脾臟間充質干細胞成骨分化后堿性磷酸酶染色，(B)為脾臟間充質干細胞成脂肪分化后油紅O染色圖4 脾臟間充質干細胞多向分化(標尺=200 μm)(A) Osteoblast differentiation of the spleen mesenchymal stem cells. ALP staining; (B) Adipocyte differentiation of the spleen mesenchymal stem cells. Oil-red O staining. Fig.4 Multi-directional differentiation of the spleen mesenchymal stem cells

相關領域研究人員采用脾臟基質細胞成份來模擬脾臟微環境，研究其對造血系統和免疫系統的調控作用，取得了較好的發現。Zhang及其同事從小鼠脾臟中分離獲得CD106陽性的內皮樣脾臟基質細胞(ESSCs)來觀察其對DC發育的影響[13]。相關研究結果表明ESSCs能夠促進CD11chighIahigh成熟DC增殖并繼續分化為有免疫負調控能力的調節性DC，從而打破了成熟DC是終末分化細胞的定論。而Tang等的進一步研究表明脾臟基質細胞促進CD34+的造血干細胞分化為調節性DC[14]。

值得關注的是，目前對于脾臟微環境的研究側重于終末分化細胞(主要是基質細胞和內皮細胞等)，而對處于發育源頭的干細胞對脾臟微環境的影響國內外文獻卻報道不多。實際上，MSC是脾臟微環境的重要參與者。首先， MSC是脾臟微環境內多種支持細胞的起源細胞，研究MSC生物學特性的改變有助于從“源頭”發現規律解決問題；其次，MSC能夠不斷自我自我復制，即自我更新，能夠為脾臟微環境提供源源不斷的“種子”。基于此，我們開展了脾臟MSC相關的研究。

目前關于小鼠脾臟MSC的報道卻不多。為了建立一種可靠的研究工具，我們在本研究中嘗試采用組織塊聯合膠原酶消化法分離獲得了小鼠脾臟MSC。從細胞形態上看，我們獲得的細胞具有成纖維樣貼壁生長的特點。從細胞免疫表型方面看，該細胞表達經典MSC表面分子。然而，細胞形態和細胞免疫表型并不足以判斷一種細胞是MSC，成纖維細胞也具有同樣的特點[15]。只有多向分化實驗是判斷MSC的“金標準”[16]，我們的結果表明該細胞同時具有成骨和成脂肪分化能力，從而確定了其是脾臟來源的MSC。當然，有關該脾臟MSC的生理和病理特性仍有待于進一步深入研究。

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Primary culture of murine spleen-derived mesenchymal stem cells by explant culture

DING Li1, ZHU Heng2, ZHANG Hai-hong3, YANG Yang1, HAN Dong-mei1, WANG Zhi-dong1, ZHENG Xiao-li1, DONG Lei1, YAN Hong-min1, LIU Jing1, ZHU Ling1, XUE Mei1, GUO Zi-kuan4, WANG Heng-xiang1

(1. Department of Hematology, Air Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing, 100142, China; 2. Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing, 100850; 3. Department of General Surgery, Air Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing, 100142; 4. Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing, 100850)

Objective This study aimed to establish a reliable primary culture protocol for preparing murine spleen-derived mesenchymal stem cells (MSCs) by tissue explant culture. Methods Healthy mouse spleens were crushed by syringe handle to harvest spleen mesenchymal tissues. Then the tiny pieces of spleen tissue were digested by collagenase II before seeded into culture flasks. The morphological characteristics of spleen tissue-derived cells were observed under the inverted microscope. Further, the surface antigen profile of the cells was analyzed by flow cytometry (FACS). The cells were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. Results The murine spleen-derived MSCs exhibited a spindle-shaped appearance. The FACS results showed that the spleen-derived MSCs highly expressed CD29, CD44, CD105 and Sca-1, but weakly expressed CD11b, CD34, CD45 and Ia. In addition, the spleen-derived MSCs steadily differentiated into osteoblasts and adipocytes in the induction medium．Conclusions A method of primary culture of murine spleen-derived MSCs by explant culture is successfully established. The harvested MSCs exhibit high purity and cell proliferation ability, and provide a reliable cell model for related researches.

Tissue explant; Cell culture; Spleen; Mesenchymal stem cells; Osteoblast differentiation; Adipocyte differentiation; Mice

國家自然科學基金項目(81500083, 81371945, 81572159, 81101342)；空軍總醫院院級課題( KZ2014023)；北京市自然科學基金項目(7132133)。

丁麗 (1975-)，女，博士，研究方向：干細胞與血液病學。E-mail: dingli7578@163.com。

王恒湘，碩士，主任醫師，從事血液系統疾病的研究與治療，wanghengxiang123@aliyun.com；郭子寬，博士，研究員，主要從事轉化醫學研究guozk@bmi.ac.cn；朱恒，博士，副研究員，主要從事干細胞與再生醫學研究，E-mail: zhudingdingabc@163.com。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0056-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.10.011

2016-06-06