土壤滅菌-生物有機肥聯用對連作馬鈴薯及土壤真菌群落結構的影響

劉 星, 張文明, 張春紅, 邱慧珍,*, 李瑞琴, 王 蒂, 沈其榮

1 甘肅農業大學資源與環境學院,甘肅省干旱生境作物學重點實驗室, 蘭州 730070 2 甘肅省農業科學院畜草與綠色農業研究所, 蘭州 730070 3 甘肅農業大學農學院, 蘭州 730070 4 南京農業大學資源與環境科學學院, 南京 210095

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土壤滅菌-生物有機肥聯用對連作馬鈴薯及土壤真菌群落結構的影響

劉 星1, 張文明1, 張春紅1, 邱慧珍1,*, 李瑞琴2, 王 蒂3, 沈其榮4

1 甘肅農業大學資源與環境學院,甘肅省干旱生境作物學重點實驗室, 蘭州 730070 2 甘肅省農業科學院畜草與綠色農業研究所, 蘭州 730070 3 甘肅農業大學農學院, 蘭州 730070 4 南京農業大學資源與環境科學學院, 南京 210095

甘肅省中部沿黃灌區是全國重要的加工型馬鈴薯生產基地, 然而因集約化生產帶來的連作障礙問題已經嚴重影響到當地馬鈴薯種植業的健康發展。結合田間試驗和相關的室內分析, 從馬鈴薯塊莖產量和品質、植株生理特征和土壤真菌群落結構等角度, 初步評估土壤滅菌和生物有機肥聯用(Ammonia Disinfection plus Bio-organic Fertilizer Regulation, ABR)對馬鈴薯連作障礙的防控效果。同對照相比, ABR處理的塊莖產量和商品薯率分別顯著增加約71.1%—152.1%和39.2%—53.3%, 但塊莖化學品質變化不大。ABR處理葉綠素含量和根系活力較CK均顯著增加, 而葉片和根系丙二醛含量顯著下降。PCR-DGGE分析發現, ABR處理顯著影響了馬鈴薯連作土壤的真菌群落結構, 表現為真菌群落的多樣性指數較CK相比顯著下降。ABR處理還有效抑制了土傳病害的滋生, 植株發病率和收獲后的病薯率較CK分別顯著下降約67.2%—82.2%和69.1%—70.5%。采用Real-time PCR評估連作土壤中3種優勢致病真菌的數量變化, 顯示ABR處理下立枯絲核菌、茄病鐮刀菌和接骨木鐮刀菌的數量在生育期內較CK均有不同程度的下降。綜合來看, 土壤滅菌和生物有機肥聯用技術在防控甘肅省中部沿黃灌區馬鈴薯連作障礙上具有較大的應用潛力, 而對土傳病害的抑制和微生物群落結構的改善是其主要的作用機理。

馬鈴薯; 連作; 生物有機肥; 土壤滅菌; 土傳病害

馬鈴薯是甘肅省的主導產業, 同時也是促進當地農民增收的主要渠道和重要的糧食來源。根據區域化生產和專業化布局的統一規劃, 甘肅中部沿黃灌區被定位為西北地區加工型馬鈴薯的主要生產基地和種薯繁殖基地。但規模化和集約化的栽培實踐以及農業訂單為導向的生產模式造成馬鈴薯多年連作, 導致植株生長發育受阻, 塊莖產量和品質下降, 土傳病害猖獗等一系列問題, 嚴重影響企業的種植效益, 危害馬鈴薯產業的健康發展。因而在探明馬鈴薯連作障礙機理的基礎上, 尋求能夠緩解或克服連作障礙的有效措施對于促進該地區馬鈴薯產業的可持續發展具有重要的理論意義和實踐價值。

微生物是土壤生態系統的重要組成部分, 其在結構和功能上具有高度的多樣性, 驅動著能量傳遞、養分循環、礦質化和腐殖化、以及污染物的降解等土壤重要的生化過程。長期連作種植條件下產生的作物生產力下降問題通常與土壤微生物因子的變化息息相關[1- 2]。連作能夠引起土壤微生物群落結構的顯著變化, 使得土壤從抑病型向導病型的方向轉變, 土傳病害滋生, 作物長勢變差并且大幅度地降低農作物的經濟產量, 而這其中大部分是真菌型的土傳病害[3- 8]。基于平板培養并結合PCR-DGGE、Real-time PCR和高通量測序等分子生物學方法, 早前的研究結果也顯示, 馬鈴薯連作導致土壤微生物群落結構顯著改變, 病原菌過渡成為優勢種群,Rhizoctoniasolani和Fusariumsp.等土傳病原真菌的數量顯著增加, 導致病害大面積發生, 塊莖產量降低[9- 15]。在國內外的連作障礙防控研究中, 病原菌的合理有效抑制是首要考慮的科學問題。健康的微生物區系是高產高效土壤的重要特征, 同時對土傳病害的抑制具有積極作用, 因此修復和重建連作土壤健康的微生物區系并使之朝著具有自主抑病能力的方向轉變同樣十分關鍵[16-19]。土壤滅菌的方法在農業生產中被廣泛使用來抑制病原菌, 但這類方法通常未能夠照顧到連作土壤微生物區系的修復和重建問題。除存在生態安全風險外, 甲基溴和三氯硝基甲烷等強力型化學滅菌劑的使用也使得土壤中的非靶標微生物類群同樣受到破壞性的影響, 微生物群落結構改變, 土壤酶活性顯著下降, 這不利于土壤可持續生產力的維持[20- 23]。僅通過播前土壤滅菌盡管能夠在短期內抑制或消除大部分的微生物, 但從生態學角度看, 滅菌完成后土壤中殘存的病原微生物會在近似于無限養分和低強度競爭的土壤介質中重新生長繁殖, 致病菌數量反彈[24- 28]。因而發展可行的替代方法來抑制土傳病害并進行有效地土壤微生物區系調控已成為研究的熱點[19]。也有學者從施用生物有機肥的角度, 通過外源微生物和有機碳的輸入來進行土壤改良進而克服連作障礙, 但這類實踐仍然存在較多的爭議且效果并不穩定[19,29]。本課題組前期試驗結果也顯示, 在長期連作條件下, 單獨的生物有機肥施用并不能有效緩解馬鈴薯連作障礙, 減少塊莖產量損失。生物有機肥雖然能夠降低病害的發生, 但是對于病害嚴重的長年連作土壤, 其防治效果仍不能將病原菌控制在不發病或不會引起重大經濟損失的閾值范圍內[29]。本研究采取連作土壤播前病原菌抑制和播后土壤微生物區系改良并重的策略, 即在馬鈴薯播前進行土壤滅菌, 而后在馬鈴薯生長發育過程中將生物有機肥直接兌水澆灌于植株根際, 增加有益菌和拮抗菌向馬鈴薯根際的輸入, 試圖通過此方法來達到病原菌的持續性抑制和人工改善連作馬鈴薯根際微生態環境的目的, 進而緩解或克服馬鈴薯連作障礙。結合田間試驗和相關室內分析, 本研究初步評估土壤滅菌和生物有機肥聯用對甘肅省中部沿黃灌區馬鈴薯連作障礙的防控效果, 特別是該方法對長期連作條件下馬鈴薯塊莖產量和品質, 植株生理生態特征, 土壤真菌群落結構和病原菌數量, 以及植株發病率的影響, 以期探索能夠緩解或克服連作障礙的有效措施, 為該地區馬鈴薯生產的可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

田間試驗設置在地處甘肅省中部沿黃灌區的白銀市景泰縣, 當地有充足的水源和良好的農業灌溉條件。地理坐標處于103°33′—104°43′ E, 36°43′—37°38′ N之間, 境內平均海拔約1500 m, 屬溫帶大陸干旱氣候, 年平均氣溫為9.1 ℃, 無霜期在141 d左右。年平均降水量為185.6 mm, 年平均蒸發量為1722.8 mm。年平均日照時數2713 h, 全縣光熱資源豐富,日照百分率62%, 年平均輻射量618.3952kJ/m2, ≥0℃的年活動積溫為3614.8 ℃, ≥10℃的年有效積溫為3038 ℃, 是我國除青藏高原外光熱資源最豐富的地區之一。供試土壤為灰鈣土, 質地為砂壤。

1.2 試驗設計與方法

田間試驗于2011年在景泰縣條山農場進行。基于試驗結果的重現性考慮, 同時選擇連作年限為5a和6a的馬鈴薯種植地塊進行田間試驗(分別以CP5和CP6表示)。供試地塊在2010年的塊莖產量僅有農場平均產量的20%—25%, 屬連作障礙重度地塊, 土傳病害發病嚴重。滅菌處理前采集供試地塊耕層土壤樣品, 基礎農化性狀見表1。田間試驗設計為：對照(CK)和土壤滅菌-生物有機肥聯用處理(Ammonia Disinfection plus Bio-organic Fertilizer Regulation, ABR)。3次重復, 隨機區組排列, 小區面積為54 m2(5.4 m×10 m)。采用統一的馬鈴薯栽培模式和施肥量, 寬壟雙行, 覆膜種植, 播種前一天切種薯, 并用濃度為1.5%的高錳酸鉀溶液消毒, 壟寬和行距分別為1.35 m和 0.30 m, 株距為0.17m, 種植密度約為5605株/667m2。聯用處理和對照均采用相同的化肥用量, 氮肥為210kg N/hm2, N∶P2O5∶K2O比例為1.4∶1.0∶2.0, 化肥分別用養分含量為15- 15- 15的復合肥和含N 46%的尿素以及含K2O 51%的硫酸鉀。播種和施肥過程機械化同步進行, 人工覆膜。化肥在播種時一次性基施, 無追肥, 其余栽培和灌溉以及田間管理措施均按農場統一方法進行。當年5月28日播種, 9月16日收獲。供試材料為當地主栽的加工型馬鈴薯品種“大西洋”, 由條山農場提供。

土壤滅菌在馬鈴薯播種前一個半月進行, 具體操作如下：將半腐熟玉米秸稈平鋪至處理小區, 氨水均勻灑到秸稈表面, 然后快速地將秸稈人工翻埋, 深度為0—20cm, 再用水澆灌使上層土壤達到飽和, 最后使用雙層地膜覆蓋整個小區, 四周用土壓實密閉防止氨揮發和風吹。土壤滅菌持續1個月時間, 而后揭膜晾曬7天, 使氨完全揮發, 最后采集少量滅菌后土壤進行室內發芽試驗, 以保證馬鈴薯正常出苗。市售氨水的用量為130L/667m2,秸稈的用量為3m3/667m2。

在馬鈴薯出苗后每間隔20 d左右進行生物有機肥的澆灌, 全生育期共澆灌3次。捅破地膜后輕輕扒開馬鈴薯植株莖基部周圍表土, 用兌水后攪拌均勻的生物有機肥懸濁液直接沿植株莖基部澆灌, 澆灌完成后將土壤回填并重新蓋上地膜, 膜上覆土并用手壓平壟面。生物有機肥的澆灌濃度為2%(w/v), 每株馬鈴薯單次的澆灌量為0.5 kg。對照小區植株澆灌等量清水。生物有機肥由南京農業大學植物營養系提供, 有機質含量為56.4%, 全氮含量為2.0%, 其中氨基酸態氮占總氮的60%以上, P2O5含量為3.7%, K2O含量為 1.1%, 含根際促生細菌和抗土傳病害功能菌數量大于108cfu/g, 拮抗型微生物菌種為Bacillussubtillis和Trichodermasp.。

表1 供試土壤的基礎農化性質

表中數據為平均值±標準差

1.3 樣品采集與分析

根據生育時期, 分別在馬鈴薯播前(即土壤滅菌結束后)、苗期、塊莖膨大期、淀粉積累期和收獲期采用五點取樣法采集土樣, 采樣均在壟上馬鈴薯行間靠近植株根系處進行, 且避開生物有機肥澆灌時間, 采樣深度為0—20 cm。將每個小區的土壤樣品混合均勻后, 密封貯存于-80 ℃冰箱中待提取土壤DNA。馬鈴薯收獲時在每個小區隨機選擇健壯程度和長勢一致的無病害植株10株, 使用鐵鍬在盡量不破壞根系的前提下將植株整株挖出, 用清水將根系緩緩沖洗干凈, 調查農藝性狀和產量構成要素后, 將植株分根、莖、葉和塊莖四部分帶回實驗室, 105 ℃下殺青30 min, 80 ℃烘至恒重, 稱量干物質, 并計算根冠比和收獲指數。各個試驗小區馬鈴薯塊莖進行實收計產, 并對薯塊進行分級, 調查商品薯率、病薯率和畸形薯率。同時在每一個小區內選取大小相近的無病害塊莖20個, 帶回實驗室制備混合鮮樣后進行化學品質指標的測定。

連作馬鈴薯植株的生理特征調查在塊莖膨大期和淀粉積累期進行。在每個試驗小區選取長勢中庸且無明顯病癥的馬鈴薯植株5株, 測定其主莖頂枝第3和第4片完全展開葉的葉綠素含量, 而后使用鐵鍬將植株帶土挖出并運回實驗室, 剪下葉片和根系部分用于測定相關的生理指標。采用SPAD值來表征葉綠素含量, SPAD 502型葉綠素儀測定, 多次重復并求取平均值; 葉片和根系的丙二醛含量采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid, TBA)顯色法測定; 根系活力采用氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium Chloride, TTC)法測定[30]。各試驗小區馬鈴薯植株病害的發生情況采用病薯率和植株發病率共同表示, 病薯率在收獲時通過調查薯塊分級計算, 植株發病率調查分別在塊莖膨大期、淀粉積累期和收獲期進行。由于試驗區域內馬鈴薯病害主要為土傳病害, 因此在植株發病率調查過程中未詳細區分病害種類。

聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術評估土壤真菌群落結構。采用Power SoilTMDNA Isolation kit(MoBio laboratories, USA)提取土壤微生物總DNA, 稱取0.25 g混勻的土壤樣品裝入提取柱中, 按說明書上的操作步驟提取100 μL土壤DNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA提取效果檢測, 提取的微生物DNA總量約為23 Kb。真菌PCR反應采用18S rDNA特異性通用引物GC-Fungi(含GC夾)和NS- 1[31]。PCR反應體系：1 μL的模板, 2 μL dNTPs(2mmol/L), 2.5 μL 10× PCR-buffer, 2.5 μL Mg2+(25mmol/L), 0.3 μL Taq DNA polymerase,引物各0.5 μL, ddH2O為15.7 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min, 然后94 ℃變性45 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 32個循環, 最后72 ℃延伸5 min, 10 ℃保溫。使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物檢測, 真菌DNA的PCR產物片段長度在370 bp左右。聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%, 變性梯度為25%—40%, PCR產物在D-Code DGGETM系統(Bio-Rad)中進行電泳, 條件為80 V, 恒溫60 ℃, 在1× TAE中電泳16 h。電泳結束后銀染, 膠片用Win RHIZOTM掃描系統成像。膠圖的譜帶分析采用凝膠定量軟件Quantity One進行。真菌群落的多樣性指數的計算基于DGGE條帶的位置和條帶的強度：H=-∑PilnPi=-∑(ni/N)ln(ni/N)，式中ni為DGGE泳道第i條泳帶亮度峰值高度,N為泳道中所有泳帶亮度峰值高度總和[32]。

采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)的方法評估土壤中3種真菌致病菌的數量動態變化, 分別是立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani), 茄病鐮刀菌(Fusarinmsolani)和接骨木鐮刀菌(Fusariumsambucinum), 標準菌株由甘肅農業大學植保系和甘肅省農科院植保所提供。供試菌株在液體培養基中25 ℃搖動培養3—5 d后, 收集菌絲團, 提取DNA。3種病原菌rDNA-ITS序列PCR擴增的特異性引物和反應體系以及反應條件同早前的文獻報道[12-13]。熒光定量PCR采用ABI 7500實時定量PCR儀進行, 擴增反應體系為20 μL：2× SYBR?Premix Ex TaqTM混合液10 μL, 引物各0.4 μL, 50× Rox Reference Dye II 0.4 μL, DNA模板2 μL, 超純水6.8 μL。擴增的反應條件：95 ℃預變性30 s, 然后95 ℃變性5 s, 60 ℃退火34 s,40個循環。在每一循環的退火階段收集熒光, 實時檢測反應并且記錄熒光信號變化, 得出擴增產物熔解曲線。將病原菌特異引物擴增后的PCR產物純化, 連接至PUC18T載體上, 轉化至大腸桿菌中, 挑取轉化后平板上的白色單克隆提取質粒DNA, 測序確定插入片段是否正確。在1.0×10-8至1.0×10-3的質粒濃度范圍內選擇6個模板梯度進行反應, 確定閾值和基線, 繪制標準曲線, 橫坐標為病原菌拷貝數的常用對數, 縱坐標為熒光定量PCR測得的Ct值。立枯絲核菌的標準曲線方程為y=-3.2330x+32.984,R2=0.9990; 茄病鐮刀菌為y=-3.4925x+36.688,R2=0.9994; 接骨木鐮刀菌為y=-3.4901x+34.811,R2=0.9978。通過Ct值, 計算待測樣品中病原菌的數量。

1.4 數據處理

田間試驗數據計算和圖表繪制在Microsoft Excel 2007軟件上進行。使用DPS軟件進行處理間差異的顯著性檢驗(One-way,P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 土壤滅菌-生物有機肥聯用對連作馬鈴薯產量品質和農藝性狀的影響

ABR處理塊莖產量較CK在CP5和CP6地塊分別顯著增加約152.11%和71.13%(表2)。處理間在單株結薯數量上并無顯著差異, 但在單株產量和單薯重量上差異明顯。兩個地塊上, ABR處理單株產量較CK分別顯著增加約70.89%和77.75%, 單薯重量也分別增加約81.49%和108.11%。從產量構成看, 單薯重量大幅增加是ABR處理下連作馬鈴薯塊莖產量增加的直接原因。ABR處理較CK相比株高有顯著增加, 兩個地塊上增幅分別約為10.62%和26.20%。但在植株莖圍、分株數和主莖分枝數上, ABR處理和CK并無顯著差異。

土壤滅菌和生物有機肥聯用顯著改善連作馬鈴薯植株生產力(表3),ABR處理整株生物量較CK在兩個地塊下分別顯著增加約36.99%和45.20%。就植株各器官而言, ABR處理下莖、葉和塊莖的生物量較CK在兩個供試地塊下均有不同程度的顯著增加。ABR處理較CK還顯著降低植株根冠比, CP5和CP6地塊上分別降低約30.36%和36.18%。統計分析表明, 根冠比與塊莖產量(R2=-0.5153,P=0.0086,n=12)和單株產量(R2=-0.4129,P=0.0242,n=12)均有著顯著或極顯著的負相關關系。ABR處理和CK在收獲指數上無顯著性差異。

表2 馬鈴薯塊莖產量及其產量構成要素和植株農藝性狀的比較

CK: 對照; ABR: 土壤滅菌-生物有機肥聯用;表中數據為3次重復的平均值±標準差, 同列的不同小寫字母表示相同地塊下處理間差異達5%顯著水平(P0.05)

表3 馬鈴薯整株和不同器官生物量的比較

收獲后馬鈴薯塊莖品質的分析結果見表4。整體來看, 土壤滅菌和生物有機肥聯用對塊莖品質影響較小, 反映在對加工型馬鈴薯最為重要的淀粉和還原糖含量上。兩個供試地塊上, ABR處理與CK的淀粉和還原糖含量均無顯著差異; 在可溶性總糖含量上, ABR處理較CK分別顯著下降約10.30%和12.24%。但在還原型維生素C含量上, ABR處理較CK分別顯著增加約67.17%和10.95%。ABR處理的可溶性蛋白質和游離氨基酸含量較CK在兩個地塊下均未顯示出一致的變化特征。

2.2 土壤滅菌-生物有機肥聯用對連作馬鈴薯商品薯率和發病情況的影響

土壤滅菌和生物有機肥聯用能夠顯著提高連作馬鈴薯的商品薯率(表5)。在CP5和CP6地塊上, ABR處理商品薯率較CK分別顯著增加約39.15%和53.25%; 而病薯率相比于CK則分別顯著下降約69.05%和70.52%。另外, 土壤滅菌和生物有機肥聯用也大幅降低連作馬鈴薯植株發病率, 不同生育時期下ABR處理較CK下降約67.23%—76.90%(CP5地塊)和74.39%—82.20%(CP6地塊)。相關分析結果表明, 塊莖產量與病薯率(R2=-0.5999,P=0.0031,n=12)和不同生育時期下植株發病率(R2=-0.5697—0.6044,P=0.0029—0.0045,n=12)之間均有著極顯著的負相關關系。

表4 收獲后馬鈴薯塊莖化學品質的比較

表5 馬鈴薯商品薯率、病薯率和植株發病率的比較

2.3 土壤滅菌-生物有機肥聯用對連作馬鈴薯植株生理特征的影響

由圖1可知, 土壤滅菌和生物有機肥聯用能夠顯著影響連作馬鈴薯植株生理特征。在CP5地塊上, ABR處理的葉綠素含量較CK在塊莖膨大和淀粉積累期分別顯著增加約9.36%和7.27%; 在CP6地塊上, 兩個生育時期也分別顯著增加約7.27%和11.17%。同時, 兩個地塊下, 不同生育時期內ABR處理較CK均顯著提高連作馬鈴薯植株的根系活力。此外, ABR處理下植株葉片和根系的丙二醛含量較CK均顯著降低, 其中以根系降幅最大, 約為62.32%—67.53%。

圖1 土壤滅菌-生物有機肥聯用對連作馬鈴薯植株生理特征的影響Fig.1 Effects of combination application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment on physiological characteristics of potato plants in monoculture systemTBS：塊莖膨大期 tuber bulking stage；SAS：淀粉積累期 starch accumulation stage；圖中數據為平均值±標準差(n=3), 不同小寫字母表示相同供試地塊下處理間差異達到顯著水平(P<0.05)

2.4 土壤滅菌-生物有機肥聯用對連作土壤真菌群落結構的影響

應用變性梯度凝膠電泳技術(DGGE)分離真菌18S rDNA片段的PCR產物, 不同DNA片段遷移為若干條帶。整體來看, 土壤滅菌和生物有機肥聯用處理改變了馬鈴薯連作土壤的真菌群落結構, 這從DGGE圖譜的條帶數量和相關條帶的明暗程度上均能體現(圖2)。進一步通過計算多樣性指數來定量化描述連作土壤真菌群落結構變化(圖3)。滅菌降低連作土壤真菌群落的多樣性, 表現在ABR處理下播前土壤真菌群落的多樣性指數較CK在兩個供試地塊上均顯著下降, 這是由于真菌病原菌受到抑制所致。但在馬鈴薯苗期, CP5地塊上ABR處理和CK間多樣性指數卻并未表現出顯著差異, 這可能與土壤滅菌結束后短期內連作土壤殘存真菌重新生長繁殖有關, 而在馬鈴薯播種過程中因耕作所帶來的土壤擾動和施肥也有利于這種真菌群落的快速恢復。在CP5地塊上, 隨著生育進程的推進并伴隨著生物有機肥的澆灌, ABR處理的真菌群落多樣性指數逐漸下降, 而CK則變化不大, 表現在塊莖膨大期和淀粉積累期, ABR處理多樣性指數較CK分別顯著下降約11.68%和24.68%, 這種處理間差異直至收獲期消失。而就CP6地塊來看, ARR處理和CK的真菌群落多樣性指數變化趨勢與CP5地塊整體一致, 只是變化程度略有不同。統計分析表明, 在塊莖膨大期和淀粉積累期, 連作土壤真菌群落的多樣性指數與植株發病率之間有著極顯著的正相關關系(R2=0.5385,P<0.0001,n=24)。

圖3 土壤滅菌-生物有機肥聯用對馬鈴薯連作土壤真菌群落多樣性的影響Fig.3 Effects of combination application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment on diversity index of soil fungal community in potato monoculture systemBS：播前 before sowing; SS：苗期 seedling stage；TBS：塊莖膨大期 tuber bulking stage；SAS：淀粉積累期 starch accumulation stage；HT：收獲期 harvest stage

2.5 土壤滅菌-生物有機肥聯用對馬鈴薯連作土壤致病菌數量的影響

圖4 土壤滅菌-生物有機肥聯用對馬鈴薯連作土壤真菌致病菌數量的影響Fig.4 Effects of combination application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment on the numbers of fungal pathogens in soils in potato monoculture system

馬鈴薯連作土壤中3種真菌致病菌數量的動態變化見圖4。可以看出, 土壤滅菌和生物有機肥聯用能夠顯著抑制土傳真菌致病菌數量。在CP5地塊上, ABR處理立枯絲核菌的數量在播前、苗期、淀粉積累期和收獲期較CK相比顯著下降約30.35%—60.40%; 而在塊莖膨大期, 盡管也表現為ABR處理低于CK, 但并未達到差異顯著水平。在CP6地塊上, ABR處理和CK土壤立枯絲核菌數量的變化趨勢與CP5地塊表現一致。此外, ABR處理較CK也顯著降低整個生育期內接骨木鐮刀菌和茄病鐮刀菌的數量, 且不同供試地塊表現基本一致。土壤致病菌數量的顯著下降是連作系統下馬鈴薯植株發病率和病薯率下降的直接原因, 相關分析結果證明, 3種致病菌數量與植株發病率間均有著極顯著的正相關關系(R2=0.2000—0.4113,P<0.01,n=36), 且立枯絲核菌(R2=0.4726,P=0.0135,n=12)和接骨木鐮刀菌數量(R2=0.3862,P=0.0310,n=12)與病薯率之間也均有著顯著的正相關關系。

3 結論與討論

3.1 土壤滅菌-生物有機肥聯用能夠有效緩解馬鈴薯連作障礙

集約化生產實踐和訂單農業種植模式導致甘肅省中部沿黃灌區出現嚴重的馬鈴薯連作障礙問題, 危害馬鈴薯產業的可持續健康發展。隨著馬鈴薯主糧化戰略的實施, 發展高效的馬鈴薯連作障礙防控技術也愈發緊迫。目前, 馬鈴薯連作障礙防控研究更多是通過田間試驗來篩選或驗證對連作障礙具有高抗性的種質資源[33], 但對于以農業訂單為導向的加工型馬鈴薯生產企業而言, 新品種的選用往往存在著極大的市場風險。并且通過基因工程手段來培育新的種質資源或抗連作的馬鈴薯新品系也進展緩慢。也有研究采用化學調控方法來進行馬鈴薯連作障礙防控, 其主要機理是改善馬鈴薯植株對連作脅迫整體的生理抗性, 比如外源水楊酸和黃腐酸等[34- 35], 但這類方法對于生產實踐來講只是治標不治本, 并且以上研究都是在模擬條件下進行的, 未得到田間驗證。本研究表明, 在大田條件下, 土壤滅菌和生物有機肥聯用能夠改善植株生長發育, 顯著增加塊莖產量, 提高植株生產力, 降低長期連作下馬鈴薯產量損失。從植株生理生態角度來看, 土壤滅菌和生物有機肥聯用處理有效緩解了馬鈴薯植株所受到的連作脅迫程度, 表現在ABR處理下植株根冠比以及葉片和根系的丙二醛含量較CK均有顯著下降。根冠比的調整是高等植物應對外界生物或非生物脅迫的基本策略, 它能反映作物的生長發育狀況, 連作條件下土壤理化和生化環境的惡化導致馬鈴薯植株根冠比顯著增加[36-37]。丙二醛是活性氧自由基對細胞質膜系統鏈式攻擊的產物, 其含量下降對連作馬鈴薯葉片和根系細胞質膜維持正常的結構和功能具有重要的意義[36]。田間試驗結果表明, ABR處理葉綠素含量和根系活力較CK均顯著增加, 連作馬鈴薯植株光合生理得到改善, 根系對水分和養分吸收增強, 這是土壤滅菌和生物有機肥聯用后連作馬鈴薯塊莖產量大幅增加的生理基礎。而土壤環境改善是馬鈴薯植株連作障礙能夠得到緩解的必要條件。

3.2 土壤滅菌-生物有機肥聯用影響馬鈴薯連作土壤真菌群落結構

大量的報道均已指出, 連作障礙問題的實質是土壤障礙問題, 而調控連作土壤微生態環境是解決連作障礙問題的突破口。根據已有的文獻資料, 本研究首次報道馬鈴薯連作土壤微生態環境調控策略并加以田間驗證, 即在抑制土傳病害致病菌的前提下通過攜帶有大量益生菌和拮抗菌的商品化生物有機肥應用來逐步改善連作土壤微生物區系。農作物長期連作種植通常導致土壤微生物群落結構發生改變, 各種土傳病害滋生, 而其中真菌型土傳病害往往居多[8]。有鑒于此, 本研究將連作土壤真菌群落結構變化作為研究重點。PCR-DGGE結果表明, 土壤滅菌和生物有機肥聯用能夠顯著影響馬鈴薯連作土壤真菌群落結構。在苗期、塊莖膨大期和淀粉積累期, ABR處理真菌群落多樣性指數較CK顯著下降約5%—20%, 并且多樣性指數與發病率之間存在著顯著或極顯著的正相關關系, 這種真菌群落結構的變化是土壤滅菌和生物有機肥澆灌共同作用的結果[29,38-39]。沈宗專等[28]指出, 滅菌處理后土壤微生物活性下降, 不利于土壤生態系統穩定, 易受其它微生物侵染。故在土壤滅菌后, 需及時補施生物有機肥, 增加土壤中有益微生物的數量及比例[27]。Wu等[39]對煙草青枯病的研究表明, 土壤滅菌和生物有機肥施用結合較單獨的土壤滅菌處理、土壤滅菌和堆肥結合相比能夠給土壤中補充大量的有益微生物, 如Bacillussp.,Paenibacillussp.,Trichodermasp.,Arthrobactersp.和Streptomycessp.等, 土壤微生物群落結構得到明顯改善, 而這是植株發病率下降的重要原因。傳統的肥料施用方法導致外源有益菌和拮抗菌遠離根系, 不能形成在根區范圍的有效定植[40-42], 本研究通過將生物有機肥進行多次兌水澆灌, 在生育期內將有益菌和拮抗菌持續性地向馬鈴薯根際補充, 不僅能夠達到抑制病原菌的目的, 還能夠改善微生物群落結構, 有助于有益菌和拮抗菌在連作馬鈴薯根系周圍的“生物墻”形成[32], 這也是本研究與已有的相關報道在方法學上的最大不同。

3.3 土壤滅菌-生物有機肥聯用降低馬鈴薯連作土壤致病菌的數量

田間試驗結果也表明, 土壤滅菌和生物有機肥聯用處理能夠顯著降低馬鈴薯連作土壤中土傳致病菌的數量。在兩個供試地塊上, ARB處理土壤中3種致病菌數量較CK在生育期內均有大幅下降, 致病菌數量與植株發病率和病薯率之間均有著顯著或極顯著的正相關關系。土傳致病菌數量的下降減少了植株和薯塊被侵染的風險, 這是發病率和病薯率顯著降低的直接原因。氨水已被證明是一種良好的化學滅菌劑, 能夠殺滅土壤中多種病原微生物, 其機理是氨能夠抑制真菌的孢子萌發和菌絲生長[28,38]。氨水滅菌后土壤真菌數量會出現顯著下降, 而細菌數量并不會發生明顯的變化, 氨水滅菌對細菌的影響要小于真菌[28], 這對于以真菌型土傳病害為主的甘肅省中部沿黃灌區馬鈴薯連作系統而言尤為重要, 能夠有效避免對土壤微生物區系的過度擾動。此外, 在本研究的土壤滅菌處理過程中, 半腐熟玉米秸稈的添加結合飽和灌水實際上也誘導了上層土壤強還原環境的形成, 這對于播前土壤中真菌型病原菌的抑制同樣具有積極作用[43]。但播前滅菌并不能完全殺滅土壤中所有的致病微生物, 因而在生育期內通過土壤調控形成對病原菌的持續抑制十分重要, 將病原菌的數量控制在不發病或輕度發病的閾值內。在本試驗中也可以看出, ABR處理和CK間土壤病原菌數量差異出現播前小于塊莖膨大和淀粉積累期的現象, 表明在播前滅菌的基礎上通過生物有機肥的澆灌能夠形成對病原菌的持續抑制。連作馬鈴薯生長過程中, 除了生物有機肥攜帶的拮抗菌直接作用于病原菌外, 土壤微生物區系結構的改變也是真菌型土傳病原菌能夠被持續抑制, 植株發病率和病薯率下降的重要原因, 這在其它研究中已被充分驗證[27,31- 32,44], 但其機理尚需進一步研究。早前關于蘋果連作障礙的研究表明, 使用溴甲烷作為化學滅菌劑并結合堆肥改良并不能改善果樹生長發育狀況和提高果實產量, 推測可能與供試作物差異以及連作障礙程度有關[45]。此外, 堆肥中缺乏有益微生物或拮抗微生物, 土壤滅菌結束后, 單靠有機碳輸入來提高土壤生物活性難以達到持續抑制致病菌的目的[19]。

綜上所述, 在甘肅中部沿黃灌區, 土壤滅菌和生物有機肥聯用能夠有效改善長期連作條件下馬鈴薯植株的生長發育和生理特征, 顯著抑制土傳病害滋生, 提高塊莖產量, 降低集約化生產條件下馬鈴薯產量損失。其主要機理在于土壤滅菌和生物有機肥聯用有效降低了連作土壤中病原菌數量和改善了土壤微生物群落結構。但在馬鈴薯長期連作條件下, 土壤細菌群落結構對土壤滅菌和生物有機肥聯用的響應本研究并未涉獵。因而在下一步研究工作中, 彌補這一短板并結合高通量測序等分子生物學技術能夠加深我們對“疾病”土壤微生物區系向“健康”土壤微生物區系的變化路徑或演進特征等方面的了解。

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Combination of the application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment and its effects on yield and quality of tubers, physiological characteristics of plants, and the soil fungal community in a potato monoculture system

LIU Xing1, ZHANG Wenming1, ZHANG Chunhong1, QIU Huizhen1,*, LI Ruiqin2, WANG Di3, SHEN Qirong4

1CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences/GansuProvincialKeyLabofAridlandCropScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China2AnimalHusbandryandPastureandGreenAgricultureInstitutes,GansuAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730070,China3CollegeofAgronomy,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China4CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

The irrigated areas along the Yellow River in central Gansu Province form one of the main potato growing regions in China. However, continuous monoculture practices, which are required for intensive production in order to maximize profits, have already impaired the development of the potato industry in the region. This is reflected in severe production losses in terms of tuber yield and quality, in the poor growth and development of potato plants, and in rapidly increasing problems related to fungal soil-borne diseases. In this study, we combined the application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment to recover potato plant productivity in a continuously monoculture system. Additionally, efforts were made to improve the micro-environment of the potato rhizosphere by inhibiting soil-borne pathogens via soil disinfection prior to sowing the potatoes and then directly irrigating plants with bio-organic fertilizer mixed with water injected into potato rhizosphere after potato emergence. The commercial bio-organic fertilizer used contained a large amount of plant growth-promoting rhizobacteria as well as antagonistic microorganisms active against known soil-borne fungal pathogens. Irrigation with bio-organic fertilizer was performed three times at 20 day intervals during the entire growing period of the potato plants. Field experiments were conducted in two plots that had previously displayed severe continuous monoculture-related problems, one of which had been continuously planted with potato crops for over five years and the other for over six years. The goal was to evaluate the effects of a combined application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment (ABR treatment) on the management of problems related to continuous potato monoculture. The field experiment included a control (CK) and an ABR treatment with three replicates of both. Specifically, the study examined tuber yield and quality, physiological characteristics of potato plants, and the structure of the soil fungal community in a long-duration monoculture system with and without soil treatment. Compared with CK, the ABR treatment significantly increased tuber yield and the ratio of marketable tubers by 71.1% to 152.1% and 39.2% to 53.3%, respectively. No distinct differences were observed between the chemical qualities of potato tubers produced by ABR or CK treatments. In terms of the physiological characteristics of potato plants, the ABR treatment significantly increased the chlorophyll content of leaves and the root vigor as compared to CK, but decreased the MDA content both in leaves and in roots, indicating that the ABR treatment could improve growth and development of potato plants in a continuous monoculture system. Based on Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE), the ABR treatment significantly affected the structure of soil fungal community, since fungal diversity index was significantly lower in ABR than in CK. Additionally, the ABR treatment effectively suppressed soil-borne diseases, with plants exhibiting a lower incidence of disease and a lower ratio of diseased tubers from 67.2% to 82.2% and 69.1% to 70.5%, respectively, when compared with CK. Real-time PCR assessment confirmed that the abundance of several pathogenic soil fungi (Rhizoctoniasolani,Fusarinmsolani, andFusariumsambucinum) in the ABR treatment was significantly lower than that in CK during the potato growth stage. In the present study, the highly significant linear correlation were revealed between tuber yield and plant disease incidence, fungal diversity index, and the abundance of soil-borne pathogens, respectively. The combined application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment is a potential approach to managing problems related to continuous potato monoculture in the irrigated areas of the Yellow River floodplain in central Gansu Province since it suppresses soil-borne diseases and improves the structure of the soil microbial community.

potato; monoculture; bio-organic fertilizer; soil disinfection; soil-borne disease

公益性行業(農業)科研專項(201103004)；國家科技支撐計劃(2012BAD06B03)；國家馬鈴薯產業技術體系(CARS- 10-P18)；甘肅省科技重大專項(1102NKDA025)

2015- 04- 11;

日期:2016- 01- 22

10.5846/stxb201504110737

*通訊作者Corresponding author.E-mail: hzqiu@gsau.edu.cn

劉星, 張文明, 張春紅, 邱慧珍, 李瑞琴, 王蒂, 沈其榮.土壤滅菌-生物有機肥聯用對連作馬鈴薯及土壤真菌群落結構的影響.生態學報,2016,36(20):6365- 6378.

Liu X, Zhang W M, Zhang C H, Qiu H Z, Li R Q, Wang D, Shen Q R.Combination of the application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment and its effects on yield and quality of tubers, physiological characteristics of plants, and the soil fungal community in a potato monoculture system.Acta Ecologica Sinica,2016,36(20):6365- 6378.