豬鏈球菌2型和小鼠巨噬細胞的相互作用顯微觀察

梁沂

（蘭州市城關區動物疫病預防控制中心，甘肅蘭州730000）

豬鏈球菌2型和小鼠巨噬細胞的相互作用顯微觀察

梁沂

（蘭州市城關區動物疫病預防控制中心，甘肅蘭州730000）

豬鏈球菌2型（Streptococcussuistype 2,SS2）是一種重要的人獸共患傳染病病原體。主要引起人和仔豬腦膜炎、心內膜炎、關節炎、肺炎和敗血癥等。本試驗選Balb/c小鼠為試驗動物，腹腔接種SS2，接種后第2、4、6、8 h分別取巨噬細胞，姬姆薩染色，光鏡觀察SS2和巨噬細胞的相互作用。發現巨噬細胞發生顯著形態改變：胞質嗜酸紅染，有吞噬顆粒；有的細胞膜顆粒樣，細胞核濃縮；胞膜邊界模糊不清，胞核結構消失；有的巨噬細胞碎裂成殘片；有的細胞融合成細胞團。結論：巨噬細胞不能有效吞噬清除SS2，而是SS2導致巨噬細胞損傷。

豬鏈球菌2型；巨噬細胞；顯微觀察

豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)是重要的人畜共患病病原，在世界范圍內廣泛流行，可以引起豬或人的敗血癥、腦膜炎、心內膜炎、關節炎及突發性死亡[1]。目前已有20多個國家和地區報道有該菌存在。在我國，1990年在廣東省首次發現2型菌株，1998年江蘇某地豬群暴發了豬鏈球菌2型引致的急性敗血性傳染病,后相繼在華南、西南、華東等地區分離到該型菌，2型豬鏈球菌病已對我國這些地區的養豬業發展構成潛在威脅，2005年，四川省資陽、內江、成都等地暴發人感染SS2疫情，發病215例，死亡39例[2]。Field(1954)在英國從暴發敗血癥、腦膜炎和關節炎的乳豬中分離出一株α-溶血豬鏈球菌，卻不能歸屬于當時所認識的19個lancefield群。de Moor等(1963年)又從荷蘭暴發敗血癥的仔豬中分離出同樣的菌株，并通過用生理生化反應和血清學方法鑒定，將其歸類到lancefield鏈球菌R、S、RS、T群。Elliot等(1966～1975)按莢膜分型方法把此菌命名為莢膜2型豬鏈球菌，并歸入D群。但后來分子生物學和數值分類法的結果表明：它們與D群沒有親緣關系，因此豬鏈球菌2型應屬于lancefield R群。黃毓茂等(1993)首次證實此病在我國存在：1998年夏天，江蘇省某地豬群暴發了急性敗血型2型豬鏈球菌病，死亡率達39.7%，造成了巨大的損失，在流行地區亦有人感染得病[2]。

目前，對SS2致病機制尚不清楚，普遍認為SS2是細胞外致病微生物，并不侵入宿主細胞。本試驗以Balb/c小鼠為SS2感染模型，通過SS2與Balb/c小鼠巨噬細胞之間相互作用的鏡下觀察，為研究SS2侵入機體的機制和有效地防控豬鏈球菌病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設備和動物

超凈工作臺，37℃恒溫箱，電冰箱，離心機，高壓滅菌器，顯微鏡，培養皿，玻板，剪刀，吸管，1mL注射器，接種環等。

試驗動物為Balb/c小白鼠(16～20 g)，雌雄各半，購自蘭州獸醫研究所實驗動物廠。

1.2 豬鏈球菌2型菌株的培養

豬鏈球菌2型凍存菌株由甘肅農業大學微生物實驗室提供。

1.2.1 菌株的復蘇 將凍存菌株接種于THB肉湯培養基中，37℃培養24h，再接種于血平板上，37℃培養18 h。肉眼可見SS2在THB肉湯培養基和血平板上的形態，革蘭氏染色觀察。

1.2.2 菌株的復壯 取血平板上的單個菌落接種于THB肉湯培養基中，37℃培養24 h。再將菌液 6 000 r/min離心10 min，0.1 mol/L PBS(pH7.4)洗兩遍并制成1×108CFU/mL菌懸液[9]。取0.3mL菌液腹腔注射小鼠，待小鼠死亡后，取病變明顯的組織器官制成組織勻漿，劃線于血平板，分離細菌。再在小鼠體內連續傳代，直到致死時間不再縮短。

1.2.3 細菌的分離純化 將小鼠體內分離出的細菌劃線接種于血平板，進行培養特性觀察，挑取單個菌落接種于THB肉湯培養基，37℃培養24 h，重新分離出細菌，染色觀察。

1.3 試驗方法

1.3.1 腹腔接種菌液 將6只小鼠隨機分為三組，每組2只，預設重復相同實驗過程2次，另外一組作為對照組；試驗組采用腹腔注射的方式接種SS2菌液，每只小鼠接種0.2mL；對照組每只小鼠腹腔注射0.2mL肉湯培養基。

1.3.2 收集巨噬細胞 將小鼠以頸椎脫臼法處死，在75%酒精浸泡1～2 min，移入超凈臺中，仰臥位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮膚，酒精棉球脫碘。用手術剪充分剪開腹部皮膚，暴露腹部肌層，再用酒精棉球消毒腹部肌層。

用注射器抽取少量沖洗液注入腹腔，用棉球輕揉腹部1～2 min，然后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開一個小口，用吸管吸取細胞懸液，移入離心管中，沖洗每只小鼠腹腔約共5mL。1000r/min離心5 min后，用含雙抗的RPMI1640培養液洗滌一次，再次離心，重懸細胞于RPMI1640培養液中。

1.3.3 巨噬細胞鏡下觀察 作為對照試驗，取小鼠正常巨噬細胞鏡下染色觀察。在干凈的載玻片上滴加一滴生理鹽水，向其中滴加一滴腹腔液，靜置10 min，使腹水細胞貼壁，棄去生理鹽水，待其稍干后，進行姬姆薩染色，在400×鏡下觀察。

1.3.4 SS2和巨噬細胞相互作用的鏡下觀察 分別在2、4、6、8h提取已接種0.2mL菌懸液的小鼠腹腔巨噬細胞，方法同上，用姬姆薩染色法染色，在400×鏡下觀察。

2 結果

2.1 豬鏈球菌2型的形態觀察及溶血特性

2型豬鏈球菌是革蘭氏陽性兼厭氧的球菌,多呈雙球形或短鏈狀；液體培養物中鏈較長，一般由8～15個球菌排成鏈狀；無鞭毛、無芽孢、不運動、無兩極著色現象。在普通營養瓊脂平板上生長貧瘠；在血平板上生長良好，長出灰白色圓形、透明、閃光、中央隆起、表面光滑露珠狀小菌落(圖1-A、B)。在THB肉湯培養基中培養時，有白色絮狀沉淀，上清渾濁，液體培養物中以長鏈狀菌為主，革蘭氏陽性，菌體直徑約lμm(圖1-C)。豬鏈球菌2型在血平板上各種溶血環，但以α溶血為主。

圖1 豬鏈球菌2型的形態特點

2.2 SS2和巨噬細胞的相互作用顯微觀察

發現巨噬細胞發生顯著形態改變：胞質嗜酸紅染，有吞噬顆粒；有的細胞膜顆粒樣，細胞核濃縮；胞膜邊界模糊不清，胞核結構消失；有的巨噬細胞碎裂成殘片；有的細胞融合成細胞團(圖2-B)。在腹腔注射感染后2、4、6、8 h的形態特征相似。而正常的巨噬細胞圓形或橢圓形，細胞質較豐富，內含有許多顆粒或空泡。細胞質染色較深，細胞輪廓明顯。胞核較小，卵圓形或腎形，多為偏心位，著色深，核仁不明顯，胞質豐富，多呈嗜酸性(圖2-A)。

圖2 染色觀察(姬姆薩染色400×)

3 討論

豬鏈球菌2型(SS2)是最為常見，也最為重要的人畜共患病病原，給公共衛生和食品安全帶來了嚴重威脅，已成為受到全球關注的人畜共患病，國內外針對豬鏈球菌病進行了大量研究，但是對該菌的致病機制尚不十分清楚。

對于SS2致病方面的研究認為，SS2致病力方面的差別與毒力因子或感染部位及方式有關，可能的毒力因子有溶菌酶釋放蛋白 (MRP)、細胞外蛋白因子(EF)、溶血素 (hemolysin,suilysin)、莢膜多糖(capsule polysaccharide,CPS)等[3]。莢膜多糖決定了2型豬鏈球菌的侵襲力，它能保護該菌在非免疫動物體內不被免疫系統的各種吞噬細胞吞噬，因此是一種毒力因子[4]。Williams和Blakemore在1990年也發現在患菌血癥的豬體內，單核細胞對SS2吞噬量很小，不足單核細胞總數的2%[5]。Charland(1998)和Smith等(1999年)證實SS2細菌表面的莢膜多糖(CPS)具有抗吞噬作用，同時發現沒有CPS的SS2突變株則很容易被吞噬、被破壞。Segura M(2004年)也發現SS2的莢膜可以抑制其被吞噬過程[6]。Segura和Gottschalk在1999年觀察到吞噬細胞對SS2有很高水平的黏附作用，認為細菌可以大量黏附與吞噬細胞表面而不是被吞噬細胞攝取，從而有利于持久的菌血癥和傳播感染[7]。細胞松弛素C處理宿主細胞對黏附沒有影響，說明SS2沒有被吞噬[8]。

本試驗以SS2侵入機體后與巨噬細胞的相互作用作為研究方向，在腹腔注射感染SS2，提取巨噬細胞，姬姆薩染色，400×鏡檢。發現有些巨噬細胞邊緣不整或模糊不清，胞質顏色變淡，胞核不清晰或消失，可能是被SS2黏附，也可能是巨噬細胞對SS2進行吞噬內化。根據相關文獻，由于SS2具有莢膜等特殊的毒力因子，有一定程度的抗吞噬能力，所以，巨噬細胞表面的細小顆粒，更有可能是SS2黏附。

也有研究表明，單個細胞的凋亡早期，細胞仍保持貼壁的多邊形形態，細胞膜有明顯吐泡現象，細胞核的嗜酸性極強，核仁結構消失，呈均勻鮮紅色。中期，細胞變圓，與鄰周細胞脫離，細胞膜完整，或有吐泡現象或沒有，核的輪廓可辨，胞漿明顯濃縮，嗜堿。晚期細胞極度濃縮，嗜堿性極強，染成深紫色，胞內無可辨結構，或者核質邊移，貼在細胞膜下呈環形[9]。鏡檢發現有些巨噬細胞核仁不清晰，甚至結構消失，但是，SS2是否能促進巨噬細胞凋亡，還需要電鏡觀察和更深入的研究。

4 結論

本研究表明，巨噬細胞不能有效吞噬清除SS2，而是SS2導致巨噬細胞損傷。

[1]Ye c,Zhu X,Jing H,et al.Streptococcus suis sequence type 7 outbreak,Sichuan,China[J].Emerg Infect Dis,2006,⑻.

[2]李茂林,嚴景生.2型豬鏈球菌病的研究概述[J].江西畜牧獸醫雜志,2005,（5）.

[3]Gottschalk M,Segura M,Xu J.Streptococcus suis infections in humans:the Chinese experience and the situation in North America[J].Anim Health Res Rev,2007,⑴:29-45.

[4]杜文金,孫融冰,黃引賢.Ⅱ型豬鏈球菌的致病因子研究進展[J].中國動物檢疫,1998,(3):47-48.

[5]Williams A E,BlackmoreW F.Pathogenesis of meningitis caused by Streptococcus suis type2[J].Infect Dis,1990,162 (2):474.

[6]Gottschalk M,Segura M,Olivier M.Encapsulated Streptococcus suis inhibits activation of signaling pathways involved in phagocytosis[J].Infect Immun,2004,72(9):5322-5330.

[7]Segura M,Stankova J,Gottschalk M.Heat-killed Streptococcus suis type 2 strains stimulate tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 production by murine macrophages[J].Infect Immun,1999,(9):646.

[8]Haataja S,Tikkanen K,Hytonen J,et al.The gal alpha 1-4 gal-binding adhesin of Streptococcus suis,a gram-positive meningitis-associated bacterium[J].Adv Exp Med Biol,1996,408:25-34.

[9]曾巧英,陸承平.豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白誘導上皮細胞融合和凋亡[J].微生物學報,2003,43(3):407-412.

[本文獲甘肅省首屆獸醫系統征文比賽三等獎]

(編輯:趙鵬飛)

S858.28

B

1006-799X(2016)19-0025-02

梁 沂（1988-），女，甘肅蘭州人，助理獸醫師，主要研究方向為動物微生物學、動物防疫、動物免疫。