葡萄籽原花青素對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

白曉，羅瑩，董想，馮艷玲，張文宇，萬(wàn)多，宋曉宇

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110122；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽(yáng) 110035）

葡萄籽原花青素對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

白曉1，羅瑩1，董想1，馮艷玲1，張文宇1，萬(wàn)多2，宋曉宇1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110122；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽(yáng) 110035）

目的研究究葡萄籽原花青素對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法建立C57BL/6小鼠肝臟缺血再灌注模型。腹腔注射原花青素，給藥量為每天20 mg/kg，注射3周。檢測(cè)肝臟氧化應(yīng)激水平以及炎性細(xì)胞因子釋放水平。結(jié)果原花青素可降低缺血再灌注導(dǎo)致的谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶活性升高，減少腫瘤壞死因子α與白介素的釋放，并提高組織的總抗氧化能力，降低丙二醛水平，從而改善缺血再灌注損傷狀況。結(jié)論原花青素可以減少肝臟缺血再灌注的損害，可以作為一種預(yù)處理藥物應(yīng)用于臨床。

葡萄籽原花青素；預(yù)處理；肝臟缺血再灌注

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肝缺血再灌注損傷是肝臟手術(shù)尤其是肝移植和肝切除中常見(jiàn)的病理現(xiàn)象［1］，炎性細(xì)胞因子和活性氧都是肝臟缺血再灌注損傷的關(guān)鍵誘因［2］。現(xiàn)階段，一般認(rèn)為使用抗氧化藥物可以降低肝缺血再灌注損傷，從而改善肝缺血性疾病預(yù)后。原花青素是從葡萄籽中提取的，可以降低細(xì)胞內(nèi)游離氧自由基，改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀況，在藥理學(xué)與生理學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值［3?4］。體外實(shí)驗(yàn)［5］表明，原花青素可以在心肌細(xì)胞中清除因缺血再灌注而產(chǎn)生的過(guò)氧化氫以及氧自由基。本研究使用葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin，GSP）對(duì)小鼠肝臟缺血再灌注模型進(jìn)行預(yù)處理，并評(píng)估其對(duì)肝臟損傷的改善作用。結(jié)果顯示該方法有效地減輕了肝臟缺血再灌注損傷，并對(duì)肝功能的恢復(fù)有一定的促進(jìn)作用。

1　材料與方法

1.1鼠肝臟缺血再灌注模型

使用C57BL/6近交系野生型雄性鼠（購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部），體質(zhì)量為20～25 g。將其分成假手術(shù)組（sham組）、缺血再灌注組（I/R組）和GSP預(yù)處理組（GSP組），每組8只，共24只。實(shí)驗(yàn)前，GSP組給予GSP（購(gòu)自天津一方科技有限公司），劑量為每天20 mg/kg，連續(xù)給藥3周；I/R組給予同等體積的生理鹽水。I/R組與GSP組小鼠注射肝素（100 U/kg）后，使用顯微血管夾夾閉肝動(dòng)脈及門靜脈以阻斷全肝血流。缺血處理30 min，移開(kāi)血管夾以進(jìn)行再灌注，1 h后取肝組織檢測(cè)急性損傷水平。sham組不進(jìn)行缺血再灌注，其他處理同I/R組。

1.2肝細(xì)胞損傷檢驗(yàn)

以血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）作為衡量肝細(xì)胞功能的標(biāo)準(zhǔn)。8 000g離心血液樣品10 min，使用生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)血液中的酶含量。

1.3ELISA和免疫印跡

取鼠的肝組織，PBS清洗后稱重。粉碎勻漿后在4℃、1 800g離心10 min，取上清。使用EBIOSCI?ENCE鼠ELISA試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF?α）和白細(xì)胞介素1（interleukin?1，IL?1）。

1.4肝細(xì)胞抗氧化能力檢測(cè)

使用PBS制備組織勻漿，4℃、1 800g離心10 min，棄去不溶沉淀，使用上清液檢測(cè)總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T?AOC）與丙二醛（malo?ndialdehyde，MDA）水平以顯示組織的氧化應(yīng)激狀況。試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以表示。不同組間的差異采用F檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1GSP可降低肝缺血再灌注損傷

經(jīng)缺血再灌注處理后I/R組的ATL與AST活性比sham組顯著升高（P＜0.01）。而與I/R組相比，GSP組ATL和AST活性均顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1　GSP對(duì)ALT與AST活性的影響Fig.1　GSP affects the activity of ALT and AST

2.2GSP可以降低炎性細(xì)胞因子水平

缺血再灌注后I/R組TNF?α和IL?1濃度比sham組有明顯升高（P＜0.01）。而與I/R組相比，GSP組TNF?α和IL?1濃度均顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2　GSP對(duì)炎性細(xì)胞因子的影響Fig.2　GSP affects the pro?inflammatory cytokines level

2.3原GSP在肝臟缺血再灌注中的抗氧化作用

I/R組T?AOC較sham組明顯降低，而MDA水平上升（P＜0.01）。經(jīng)GSP處理后，T?AOC與MDA水平均回復(fù)到較正常水準(zhǔn)（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3　GSP調(diào)節(jié)組織氧化應(yīng)激水平Fig.3　GSP regulates the level of oxidative stress

3　討論

近年來(lái)，人們對(duì)天然植物提取物入藥應(yīng)用于臨床治療的關(guān)注日漸增多。而在具有生物學(xué)活性的植物提取物中，抗氧化劑始終是研究的重點(diǎn)。天然抗氧化藥物主要包括某些酶類、維生素類、黃酮類以及一系列合成物（如二硫蘇糖醇、丁羥甲苯等）。這些黃酮類/酚類天然抗氧化劑在抗炎、降血脂、抗?jié)儭⒖菇M織增生、預(yù)防腫瘤以及調(diào)節(jié)免疫方面，均具有廣泛的藥理學(xué)與毒理學(xué)活性［6?7］。已有研究［8］表明，反式白藜蘆醇可用于肝臟缺血再灌注模型，并對(duì)肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。從葡萄籽中提取的原花青素是一種天然的低毒性抗氧化劑，經(jīng)吸收后在體內(nèi)具有很高的生物學(xué)活性，對(duì)遭受損傷的細(xì)胞有保護(hù)作用［9］。

目前對(duì)于GSP在肝臟缺血再灌注損傷中作用的報(bào)道還較少，因此本研究使用GSP對(duì)小鼠肝臟模型進(jìn)行缺血前處理，評(píng)估其對(duì)缺血再灌注損傷的改善狀況。研究結(jié)果表明腹腔注射GSP每天20 mg/kg，連續(xù)注射3周，可有效降低肝臟缺血再灌注損傷。

本研究探討了GSP在減輕肝臟缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。結(jié)果表明GSP可以調(diào)節(jié)T?AOC能力與降低MDA水平，從而減輕組織氧化應(yīng)激。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)GSP可以抑制細(xì)胞因子釋放，進(jìn)而減少細(xì)胞損傷，促進(jìn)細(xì)胞存活。

綜上所述，本研究表明GSP可以提高氧自由基清除率并抑制炎性細(xì)胞因子釋放，從而減輕肝臟缺血再灌注造成的損傷，可能作為預(yù)防缺血再灌注的新型天然藥物，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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（編輯陳姜）

Protective Effect of Grape Seed Proanthocyanidin against Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury

BAI Xiao1，LUO Ying1，DONG Xiang1，F(xiàn)ENG Yanling1，ZHANG Wenyu1，WAN Duo2，SONG Xiaoyu1
（1.Institute of Translational Medicine，Key Laboratory of Medical Biology，Ministry of Education，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Department of Nephrology，The Second Affiliated Hospital，Shenyang Medical College，Shenyang 110035，China）

ObjectiveTo investigate the protective effect of grape seed proanthocyanidin（GSP）against hepatic ischemia and reperfusion injury（IRI）.MethodsTo build murine warm hepatic IRI model，C57BL/6 mice

30 min hepatic ischemia process，and then the mice were sacrificed after 1 h reperfusion.The mice were administered with GSP intraperitoneally 20 mg/kg for 3 weeks.Two pathways related to IRI includ?ing oxidative stress and pro?inflammatory cytokines release were examined.ResultsData showed that GSP could significantly reduce hepatic IRI by decreasing the activity of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase，lessening tumor necrosis factor?α and interleukin?1 expres?sion，enhancing tissue total antioxidative capacity and reducing malondialdehyde level.ConclusionGSP can protect liver against IRI，which can be used as pharmacological preconditioning in clinical practice.

grape seed proanthocyanidin；preconditioning；hepatic ischemia and reperfusion injury

R34

A

0258-4646（2016）11-0982-03

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.11.006

國(guó)家自然科學(xué)基金（31300963）；遼寧省自然科學(xué)基金（201302105）

白曉（1986-），女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士.

宋曉宇，E-mail：xysong@mail.cmu.edu.cn

2016-03-24

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