番茄抗黃化曲葉病毒病雜交后代比較

張 杰， 王先裕， 荊子桓， 孫嵐明

(廣西大學農學院，廣西南寧530000)

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番茄抗黃化曲葉病毒病雜交后代比較

張 杰， 王先裕*， 荊子桓， 孫嵐明

(廣西大學農學院，廣西南寧530000)

[目的]篩選黃化曲葉病毒病抗性高的番茄雜交子1代。[方法]通過番茄雜種子1代的栽培，觀測各組合的田間生長情況，對各組合果實營養品質指標進行測定和分析，采用分子標記等方法對其黃化曲葉病毒病抗性進行鑒定。[結果]雜交子1代TW002和TW008果實品質較優，在加工、運輸、貯藏方面具有優勢；與TW002相比，TW008的果實商品率更高、營養品質更好。黃化曲葉病毒病抗性基因檢測結果表明，Ty-1中TW001、TW004、TW008和TW010為抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009為雜合材料，TW002、TW007為感病材料；Ty-2中均為感病材料；Ty-3中TW001、TW002、TW004、TW007、TW009為抗病雜合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010為感病純合材料。[結論]該研究可為抗黃化曲葉病毒病番茄材料的選育提供理論依據。

番茄黃化曲葉病毒；分子標記；雜交子1代；選擇；營養品質

番茄(LycopersiconesculentumMiller.)為雙子葉植物綱茄科 (Solanaeeae)番茄屬(Lycopersion)植物。番茄營養豐富，富含人們正常生活所需的各種物質，如蛋白質、碳水化合物、維生素C、胡蘿卜素和番茄紅素等[1]。番茄黃化曲葉病是由番茄黃化曲葉病毒( Tomato yellow leaf curl cirus，TYLCV) 引起的，該病毒主要通過煙粉虱(Bemisiatobaci)傳染給番茄[2]。該病傳播迅速、范圍廣、危害程度嚴重、持續久，嚴重影響番茄的品質和產量。目前番茄黃化曲葉病毒病的防治措施主要是使用抗性品種和農藥。長期使用農藥易出現農藥殘留、土壤板結、環境污染、毒素積累等問題，不利于生態農業的發展以及環境的保護，因此現在多采用綜合生物防治的方法來防治番茄黃化曲葉病毒病[3]。1994 年，國外學者研究發現智利番茄是最好的番茄抗黃化曲葉病毒病資源[4]。Vidavsky等[5]從番茄中發現抗黃化曲葉病毒基因。Zamir等[6]利用RFLP標記，首次將番茄抗黃化曲葉病的基因定位在6號染色體上(位于著絲粒端)，并將其命名為Ty-1，且RFLP標記方法也被應用于Ty-1的抗病輔助育種中。Hanson等[7]以野生多毛番茄為材料，利用RFLP標記將番茄抗黃化曲葉病的基因定位在了11號染色體的長臂終端上，并將其命名為Ty-2，該方法也被應用于Ty-2的抗病輔助育種中。Ji等[8]以智利番茄為材料，利用RAPD標記確定了抗性位點在第6號染色體上，并將抗性基因命名為Ty-3和Ty-3a。目前，我國番茄黃化曲葉病毒病的危害日趨嚴重，且番茄抗黃化曲葉病毒病的材料品種較少。基于此，筆者以番茄雜交子1代為研究對象展開試驗，觀測不同組合材料的田間生長情況、農藝性狀表現，利用分子標記等方法對其黃化曲葉病毒病抗性進行鑒定，以期篩選出黃化曲葉病毒病抗性高的番茄雜交子1代，為抗黃化曲葉病毒病番茄材料的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗所用的雜交子1代按TW001～TW010進行編號。這10份材料均由廣西大學農學院園藝系番茄課題組提供；對照組(CK)為當前市場上種植面積較為廣泛的“艾比利”品種。

1.2 果實營養品質測定項目和方法 每個小區隨機抽取3個第2穗外觀較好的番茄果實，重復3次，取平均值。果實可溶性固形物含量采用手持折光儀測定[9]；可滴定酸含量采用酸堿滴定法(GB10474-89)測定[10]；抗壞血酸含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法測定[11]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[12]；番茄紅素含量采用萃取比色法測定；計算糖酸比(可溶性糖與可滴定酸的比值)；利用隸屬函數[13]判定果實綜合品質，其基本原理是根據評價的標準來構造多個隸屬函數，然而每一個評價指標在各個隸屬函數的對應程度不同，通過模糊計算，可以得到綜合指標對各個隸屬函數的數值得分影響。

1.3 番茄抗性基因的檢測

1.3.1 試劑和儀器。試劑：2×CTAB(pH 8.0)、NaCl、 EDAB、Tris-d(pH 8.0)、氯仿、異丙醇、醋酸鈉、瓊脂粉、液氮、無水乙醇、TE緩沖液、dNTP、TEA溶液、TaqDNA聚合酶、MgCl2、BUFFER、6×Loading Buffer、染色堿、2 000 DNA Marker、MIX酶、nuclear free water。儀器：研缽、水浴鍋、振蕩機、移液槍、點樣板、冰箱、磨樣機、Sigma1冷凍離心機、ABI 2720 PCR儀、Q5000型核酸蛋白儀、君意JY600C型電泳儀、微波爐、ChemiDoc MP型凝膠成像系統。

1.3.2 DNA的提取。采用改良的CTAB法對番茄材料基因組的DNA進行提取。

1.3.3 PCR反應體系。①黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1參照華中農業大學番茄課題組開發的雙重SNP標記[14]；反應體系20 μL：2.0 μL的10× Buffer with Mg2+，0.4 μL的dNTPs(2.5 mM)，正向引物和反向引物(100 μmol/L)各0.2 μL，1.0 μL的DNA 模板(200 ng/μL)，0.2 U的TaqDNA聚合酶，ddH2O 補足20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性，1 min，58 ℃復性，1 min，72 ℃延伸，1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保持。②黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3參照中國農業科學院蔬菜花卉研究所提供引物程序進行檢測。反應體系10 μL： 5 μL的2×GoTaqGreen Master Mix，正向引物和反向引物各0.25 μL，3.50 μL的滅菌ddH2O，1.00 μL的DNA模板(1 000 ng/μL)。PCR反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性，40 s，55 ℃復性，40 s，72 ℃延伸，1 min 30 s，32個循環；最后72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.3.4 PCR及酶切產物檢測。PCR產物及酶切產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上 220 V 恒壓電泳15 min，結果采用2 000 DNA Marker染色，ChemiDoc MP型凝膠成像系統拍照。

1.4 數據處理 采用Excel 2007以及SPSS 20.0軟件對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 番茄果實品質比較 由表1可知，TW001～TW010番茄果實中的可溶性固形物含量在6.05%～7.64%，其中TW008果實中可溶性固形物含量最高，為7.64%，TW003果實中可溶性固形物含量最低，為6.05%，TW001與TW007之間差異不顯著，其余雜交子1代之間差異顯著；番茄果實中的可滴定酸含量在327.89～657.55 mg/100 g，其中TW004果實中可滴定酸含量最高，為657.55 mg/100 g， TW001果實中可滴定酸含量最低，為327.89 mg/100 g，TW001與TW004、TW007之間均差異顯著，其他材料間均差異不顯著；番茄果實中番茄紅素含量在24.72～46.79 mg/100 g，其中TW008果實中番茄紅素含量最高(為46.79 mg/100 g)，TW003果實中番茄紅素含量最低(為24.72 mg/100 g)，TW001、TW003、TW005、TW007、TW008、TW010、CK之間均差異顯著，TW002與TW006之間差異不顯著；番茄果實中抗壞血酸含量在13.35～31.72 mg/100 g，其中TW008果實中抗壞血酸含量最高，TW003果實中抗壞血酸含量最低，10個雜交子1代材料中除TW010外，其余材料之間均差異顯著；番茄果實中可溶性糖含量在297.66～526.80 mg/100 g，其中TW002果實中可溶性糖含量最高，TW006果實中可溶性糖含量最低，這10個雜交子1代材料之間均差異顯著；番茄果實中糖酸比在0.49～1.22，其中TW001果實中糖酸比最高， TW007果實中糖酸比最低，這10個雜交子1代材料之間均差異顯著。根據隸屬函數值可知，TW008得分最高，說明其番茄果實品質最好，TW001、TW002、TW004、TW005、TW007、TW008、TW009和TW010的數值均高于CK，因此，這8個材料均可在廣西地區進行推廣種植。

表1 大果番茄營養品質對比

注：同列不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著。

Note： Different lowercases in the same column indicated significant differences at 0.05 level between treatments.

2.3.2 抗性鑒定分析

2.2.1 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1檢測結果。Ty-1基因的雙重SNP標記可檢測出抗病純合、抗病雜合、感病純合材料，當純合抗病材料經過PCR電泳過后，會出現1條965 bp的條帶，雜合抗性材料會出現965 bp和1 343 bp 2條DNA帶，而純合感病材料會出現1條1 434 bp的條帶。由圖1可知，TW001、TW004、TW008和TW010為抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009為雜合材料，TW002、TW007為感病材料。

圖1 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1檢測結果Fig. 1 Detection results of resistance gene Ty-1 of yellow leaf curl virus

2.2.2 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2檢測結果。含有黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2的材料可擴增出300 bp的條帶，不含黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2的感病材料則擴增出600 bp的條帶。由圖2可知，所有的材料均為感病材料。

圖2 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2檢測結果Fig. 2 Detection results of resistance gene Ty-2 of yellow leaf curl virus

2.2.3 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3檢測結果。含有黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的材料可擴增出500 bp的條帶，不含黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的材料可擴增出320 bp的條帶。由圖3可知，TW001、TW002、TW004、TW007、TW009為抗病雜合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010為感病純合材料。

圖3 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3檢測Fig. 3 Detection results of resistance gene Ty-3 of yellow leaf curl virus

3 結論與討論

(1)該試驗結果表明，雜交子1代TW002和TW008的可滴定酸、可溶性糖、抗壞血酸含量均較高，其口味、風味、甜酸比、酸堿度等較優，更有益于貯藏，在加工、運輸方面均有優勢，與TW002相比，TW008的果實商品率更高、營養品質更好。與對照品種“艾比利”相比，10個雜交子1代中有8個得分高于“艾比利”，尤其是TW008，適合大面積推廣。

(2)黃化曲葉病毒病抗性基因檢測結果表明，Ty-1中TW001、TW004、TW008和TW010為抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009為雜合材料，TW002、TW007為感病材料；Ty-2中均為感病材料；Ty-3中TW001、TW002、TW004、TW007、TW009為抗病雜合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010為感病純合材料。TW001、TW004為純合體且抗Ty-1和Ty-3，可作為親本材料；TW003、TW005、TW006、TW009均為雜合材料，需繼續純化；TW002、TW007材料經濟性狀一般，但感Ty-1、抗Ty-3。TW008感病但經濟性狀好，可作母本，TW010感病又無性狀，應該淘汰。

[1] 程智慧.園藝學概論[M].2版.北京：中國農業出版社,2010：183-188.

[2] PENG J Y，ZHAN L B，DONG F Q，et al.A comparative study of chromatographic methods for separating chemical compounds fromSpiranthesaus-tralis(R.Brown) Lindl roots[J].Separation and purification technology，2008，59(3):262-269．

[3] 丁雪玲.番茄黃化曲葉病毒病的生物防治研究[D].南京：南京農業大學，2013.

[4] MICHELSON I,ZAMIR D,CZOSNEK H.Accumulation and translocation of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) in aLycopersiconesculentumbreeding line containing theL.chilenseTYLCV tolerance geneTy-1[J]．Phytopathology，1994，84(9): 928-933．

[5] VIDAVSKY F，CZOSNEK H．Tomato breeding lines resistant and tolerant to tomato yellow leaf curl virus issued fromLycopersiconhirsutum[J]．Phytopathology，1998，88(9):910-914．

[6] ZAMIR D,EKSTEIN-MICHELSON I,ZAKAY Y,et al.Mapping and introgression of a tomato yellow leaf curl virus tolerance gene,Ty-1[J].Theoretical and applied genetics,1994,88(2):141-146.

[7] HANSON P M,BERNACCHI D,GREEN S,et al.Mapping of a wild tomato introgression associated with tomato yellow leaf curl virus resistance in a cultivated tomato line[J].Journal of the American societyof horticultural science, 2000,125(1):15-20.

[8] JI Y F, SCOTT J W,SCHUSTER D J, et al.Molecular mapping ofTy-4, a new tomato yellow leaf curl virus resistance locus on chromosome 3 of tomato[J].Journal of the American society for horticultural science,2009,134(2):281-288.

[9] 羅穎.番茄可溶性固形物含量與相關生理生化指標關系研究[D].石河子：石河子大學,2010.

[10] 李玲，李娘輝，蔣素梅，等.植物生理學模塊實驗指導[M].北京：科學出版社，2009:48-59.

[11] 李合生.植物生理生化實驗手冊[M].北京：高等教育出版，2001：130，134-138.

[12] 畢穎,劉燕,張平,等.蒽酮比色法測定大豆乳清廢水中總糖含量[J]. 大豆通報,2006(3):24-25.

[13] 韓瑞宏，盧欣石，高桂娟，等.紫花苜蓿抗旱性主成分及隸屬函數分析田[J].草地學報，2006，14(2):142-146.

[14] 葛乃蓬,崔龍,李漢霞，等.番茄抗黃化曲葉病毒基因Ty-1的雙重SNP標記的開發[J].園藝學報,2014，41(8):1583-1590.

科技論文寫作規范——討論

著重于研究中新的發現和重要方面，以及從中得出的結論。不必重復在結果中已評述過的資料，也不要用模棱兩可的語言，或隨意擴大范圍，討論與文中無多大關聯的內容。

Comparison on Resistance to Tomato Yellow Leaf Curl Disease of Hybrid Offspring

ZHANG Jie, WANG Xian-yu*, JING Zi-huan et al

(College of Agronomy, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530000)

[Objective] To screen the tomato hybrid F1with high resistance to tomato yellow leaf curl disease. [Method] Through the cultivation of tomato hybrid F1, field growth situation of each combination was observed. The fruit nutritional quality index of each combination was detected and analyzed. Molecular marker and other methods were used to identify the resistance to yellow leaf curl disease. [Result] Fruit qualities of F1TW002 and TW008 were relatively better. Genetic testing results of yellow leaf curl disease showed that TW001, TW004, TW008 and TW010 inTy-1 were all resistant materials; TW001, TW002, TW004, TW007 and TW009 inTy-3 were disease-resistant hybrid materials; TW003, TW005, TW006, TW008 and TW010 were infected homozygous materials. [Conclusion] This research provides theoretical foundation for the resistance breeding of tomato yellow leaf curl disease.

Tomato yellow leaf curl virus; Molecular marker; Hybrid F1; Selection; Nutritional quality

廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂科攻14121006-5-2，桂科合14123001-3，桂科攻13254002-2)；國家大宗蔬菜產業技術體系桂林綜合試驗站項目(CARS-25-G-37)；百色國家農業科技園區建設示范項目(桂科能1598022-1-1)；番茄新品種選育及示范(BB160112)。

張杰(1994-)，男，廣西玉林人，本科生，專業：園藝。*通訊作者，研究員，從事番茄抗病育種與新品種選育。

2016-08-17

S 641.2

A

0517-6611(2016)29-0014-03