分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定動物源性食品中11種β-受體阻斷劑殘留

郝 杰，姜 潔，邵瑞婷，丁學妍，史 娜，路 勇

(北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京 100041)

?

分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定動物源性食品中11種β-受體阻斷劑殘留

郝 杰，姜 潔*，邵瑞婷，丁學妍，史 娜，路 勇

(北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京 100041)

建立了一種分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯四極桿質譜法同時測定動物源性食品中11種β-受體阻斷劑殘留量的方法。樣品經β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解后，上清液調節(jié)pH值，以異丙醇-乙酸乙酯(5∶5，體積比)萃取，有機相吹干后復溶過分子印跡固相萃取柱凈化。樣品經BEH C18色譜柱分離，以甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)進行梯度洗脫，電噴霧電離正離子模式下采用多反應監(jiān)測，基質加標曲線定量。11種β-受體阻斷劑在0.05～10 μg/kg范圍內線性關系良好，相關系數均不小于0.991，方法檢出限和定量下限分別為0.02～0.1 μg/kg和0.05～0.25 μg/kg。在豬肉、豬肝基質中3個添加水平下，平均回收率分別為73.2%～108.3%及70.2%～98.2%，相對標準偏差分別為1.3%～9.5%及3.7%～9.8%。該方法快速、靈敏、準確，適用于β-受體阻斷劑多組分殘留的測定。

分子印跡固相萃取；液相色譜-串聯質譜法；β-受體阻斷劑；殘留檢測

β-受體阻斷劑是作用于β-受體，能選擇性地與β-腎上腺素受體結合，從而拮抗神經傳遞質和兒茶酚胺對β-受體激動作用的一類物質[1]。在臨床上，針對冠心病、高血壓、心律失常等心血管系統(tǒng)疾病的治療發(fā)揮著極其重要的作用，是目前應用最廣泛的降低心率的藥物之一[2]。但β-受體阻斷劑會造成對心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多方面的副作用，過量使用甚至會引起中毒反應[3]。

產肉動物，特別是畜類動物，自身肌體沒有足夠的防御機制以應對運往屠宰場途中受到的外界刺激，在運輸過程途中可能會因心力衰竭而死亡[4]。這類現象會導致肌肉組織中某些代謝通路的改變，另外，在后續(xù)加工當中也存在溫度或其他因素的刺激，最終會導致PSE肉(Pale soft exudative)的產生，俗稱水豬肉、熱霉肉。PSE肉是一種劣質豬肉，可帶來巨大經濟損失[5]。為了避免PSE肉的產生，在屠宰前的運輸過程中，鎮(zhèn)靜類藥物和β-受體阻斷劑類藥物會被非法注射到動物體內，以減少應激現象的發(fā)生，而這些藥物往往在屠宰前數小時內被大劑量直接用藥，因而相對其他獸藥會造成更高的殘留量和更大的風險危害[6]。另外β-受體阻斷劑也是國際奧林匹克委員會禁止使用的興奮劑[7]，從食源性興奮劑控制的角度，也需要加大動物源性食品中β-受體阻斷劑的嚴格監(jiān)控。目前國際上針對β-受體阻斷劑卡拉洛爾(Carazolol)在動物組織中的殘留限量已有明確要求[8]。

目前，動物源性食品中β-受體阻斷劑的相關研究較少，由于其化合物結構多為堿性中等極性化合物，因此分析手段上常采用離子交換機理的固相萃取結合液相色譜-串聯質譜技術[9-13]。新型的分子印跡固相萃取技術，結合了固相萃取的易操作和實用性以及免疫親和色譜的高選擇性和穩(wěn)定性等特點，可實現同一類化合物高效、同步的前處理凈化，特別適用于食品復雜基質中多殘留組分的分析[14-15]。本文建立了分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜檢測動物源性食品中11種β-受體阻斷劑的分析方法。該方法靈敏，回收率高，穩(wěn)定性好，相比于傳統(tǒng)方法可以達到更低的檢出限，且更適用于肝臟等復雜基質，可滿足殘留檢測的需要。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀(Acuqity UPLC/Xevo TQ-S，美國Waters公司)；純水儀(Milli-Q，美國Millipore公司)；高速冷凍離心機(3K18，美國Sigma公司)；分子印跡固相萃取柱(Supelco Supel MIP beta-receptors 25 mg/10 mL，美國Sigma-Aldrich公司)。

拉貝洛爾、倍他洛爾、噴布洛爾、阿替洛爾、比索洛爾、阿羅洛爾、索他洛爾、納多洛爾(CAS:42200-33-9)、奈必洛爾、卡維地洛、美托洛爾(純度≥98%，德國Dr.Ehrenstofer GmbH)；甲醇、乙腈、異丙醇、乙酸乙酯、甲酸(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(100 000 Unit/mL，德國Merck公司)；乙酸銨(質譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；乙酸鈉(色譜純，北京化學試劑廠)。

所有標準物質用甲醇溶解成1 000 μg/mL的儲備液，保存于-20 ℃冰箱內，每半年對其含量進行校準。

1.2 樣品制備

豬肉及豬肝樣品去除脂肪進行均質，精確稱取均質后的樣品2.00 g于50 mL聚四氟乙烯離心管內，加入10 mL 0.2 mol/L的乙酸鈉-乙酸緩沖液(pH 5.2)，充分渦旋均質后，加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，于37 ℃下200 r/min振蕩酶解6 h以上。取出后冷卻至室溫，渦旋后以10 000 r/min離心10 min，取出全部上清液至另一干凈離心管中，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調至pH 11.0，加入10 mL飽和氯化鈉及10 mL異丙醇-乙酸乙酯(體積比5∶5)溶液，充分渦旋提取10 min，于10 000 r/min下離心，取上層有機相清液在40 ℃下氮氣吹干。加入5 mL 酶解用乙酸鈉-乙酸緩沖液，充分溶解殘渣后上柱。

取規(guī)格為25 mg/10 mL的分子印跡柱用3 mL甲醇和3 mL水活化，溶解液全部上柱，控制流速在1滴/s，依次用3 mL水、3 mL 60%的甲醇水溶液和1 mL甲醇淋洗MIP柱，真空負壓抽干后，用2 mL含1%甲酸的甲醇溶液洗脫，控制流速在1滴/s，收集洗脫液于40 ℃下用微弱氮氣流吹干，用1 mL初始比例流動相復溶，過0.2 μm親水性聚丙烯膜，供上機測定。

1.3 液相色譜-質譜條件

1.3.1 色譜條件 液相色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A為甲醇，B為5 mmol/L 乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)；流速：0.45 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。梯度洗脫條件：0～0.5 min，95%～80%B；0.5～1.0 min，80%～60%B；1.0～2.5 min，60%～40%B；2.5～3.0 min，40%B；3.0～3.5 min，40%～1%B；3.5～4.5 min，1%B；4.5～5.0 min，1%～95%B；5.0～6.0 min，95%B。

1.3.2 質譜條件 電噴霧離子源，正離子模式，毛細管電壓2.8 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h，錐孔氣流量150 L/h，霧化氣壓力7.0 bar，碰撞氣流量0.17 mL/min。11種化合物的質譜參數見表1。

表1 11種β-受體阻斷劑的色譜-質譜參數

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜條件的優(yōu)化

選用BEH C18超高效液相色譜柱作為分離介質，對比了甲醇、乙腈與水、0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L乙酸銨水溶液及5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)作為流動相時的分離情況。結果表明，由于11種β-受體阻斷劑均使用正離子模式檢測，在流動相中加入酸可有效增強信號響應，同時加入緩沖鹽可以改善峰形。因此，最終選擇甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)作為流動相。

圖1 11種β-受體阻斷劑的色譜分離圖(0.5 ng/mL)Fig.1 Chromatogram separation of 11 β-blockers at concentration of 0.5 ng/mL1.sotalol；2.atenolol；3.nadolol；4.arotinolol；5.metoprolol；6.labetalol；7.bisoprolol；8.carvedilol；9.betaxolol；10.nebivolol；11.penbutolol

使用電噴霧質譜在正離子掃描模式下，用質譜直接進樣的方式，分別確定11種β-受體阻斷劑的質譜參數。通過優(yōu)化毛細管電壓、錐孔電壓和碰撞能量等參數，選取響應豐度較高的幾個碎片離子作為子離子。再通過配制空白基質標準溶液，排除易受基質干擾的碎片，得到2對監(jiān)測離子對，選擇響應豐度較高、干擾較少的作為定量離子對。圖1為優(yōu)化條件下11種β-受體阻斷劑的總離子流圖。

2.2 樣品前處理過程的優(yōu)化

β-受體阻斷劑的殘留監(jiān)測通常為痕量測定，前處理方法需達到濃縮、凈化的效果。吳永寧等[16]對酶解條件進行了深入研究，具有較高的參考意義。本文主要對酶解后的提取過程與凈化條件進行優(yōu)化。

2.2.1 提取溶劑的選擇 在酶解之后，β-受體阻斷劑在酸性條件下以離子態(tài)游離于緩沖液中，將提取液調節(jié)至pH值呈堿性，使目標化合物的電離平衡向分子方向移動，目標化合物以不解離的分子狀態(tài)被不互溶的有機溶劑提取，水相中留下pKa值不相同的其他可溶雜質。從提取凈化的策略可知，用于提取的有機試劑的組成和配比是這一步驟中影響回收率的關鍵，因此對提取溶劑種類(乙酸乙酯、異丙醇、乙腈)進行了優(yōu)化，并考察了其不同比例的提取效率。結果表明，使用乙腈導致兩相分配不佳。而乙酸乙酯和異丙醇對11種化合物的分配各異，采取不同配比時所得到的提取效率也不同。進一步考察了不同異丙醇-乙酸乙酯比例對11種β-受體阻斷劑的萃取情況，在兼顧所有化合物的原則下，最終使用異丙醇-乙酸乙酯(5∶5)進行提取。

2.2.2 凈化條件的選擇 對比了極性分配固相萃取柱(Waters Sep-pak C18，500 mg/6 mL)、親水親脂分配固相萃取柱(Waters Oasis HLB，150 mg/6 mL)、混合強陽離子固相萃取柱(Waters Oasis MCX，150 mg/6 mL)、混合強陽離子固相萃取柱(DikmaProElut PXC，150 mg/6 mL)、分子印跡固相萃取柱(SupelcoSupel MIP beta-receptors，25 mg/10 mL) 5種固相萃取柱的凈化效率。結果表明，在C18柱及HLB柱上，由于是共價鍵結合分配機理，故回收率不理想。MCX和PXC均基于苯磺酸型強陽離子交換機理，已有報道也多使用該類型的固相萃取柱，且大部分化合物能夠達到凈化效果，但個別化合物(如索他洛爾)回收率不佳，僅有45.6%。MIP柱具備特異性的β-受體結構，能夠特異性地結合β-受體阻斷劑中的苯乙醇胺母核，使得MIP柱凈化具有高度專一性和較好的回收率。對比MCX柱及PXC柱，多數化合物在MIP柱上能夠達到更好的回收率，11種化合物的回收率均大于75%，同時在前處理過程中使用低溫和pH值調節(jié)等步驟也能有效除去脂肪和蛋白質的干擾。因此實驗選擇分子印跡固相萃取柱進行凈化。

2.3 方法驗證

2.3.1 標準曲線與檢出限 在空白樣品中分別添加0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2，5，10 μg/kg的β-受體阻斷劑混合標準物質，進行前處理和測定。以11種β-受體阻斷劑的響應峰面積(Y)為縱坐標，對應濃度(X，μg/kg)為橫坐標繪制工作曲線。以3倍信噪比計算方法檢出限(LOD)，10倍信噪比確定方法定量下限(LOQ)。11種β-受體阻斷劑的線性方程、相關系數、線性范圍及檢出限、定量下限結果見表2。各化合物在0.05～10 μg/L范圍內呈良好的線性關系，其線性相關系數(r2)為0.991 2～0.999 1。各化合物的檢出限和定量下限分別為0.02～0.1 μg/kg和0.05～0.25 μg/kg。

表2 11種β-受體阻斷劑的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限及定量下限

2.3.2 方法的回收率與精密度 分別取動物肌肉、肝臟空白樣品，添加低、中、高3個不同濃度水平的11種β-受體阻斷劑混合標準溶液，優(yōu)化條件下測定目標化合物。每個濃度水平平行測定6次，結果見表3。11種化合物在豬肉中的平均回收率為73.2%～108.3%，相對標準偏差(RSD)為1.3%～9.5%；在豬肝中的平均回收率為70.6%～98.2%，RSD為3.7%～9.8%。其準確度與精密度能滿足殘留檢測的要求。

表3 11種β-受體阻斷劑的回收率及相對標準偏差

圖2 陽性質控樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of positive QC sample

2.4 實際樣品的測定

隨機選取市售豬肉、豬肝共10份，同時做陽性質控樣品。應用建立的方法對樣品進行11種β-受體阻斷劑的測定。結果在陽性質控樣品中檢出卡維他洛0.497 μg/kg(圖2)，其余樣品均未檢出。

3 結 論

本研究采用分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯四極桿質譜技術，建立了豬肉及豬肝中11種β-受體阻斷劑殘留的同時檢測方法。經方法驗證，該方法檢出限低、回收率高、精密度好，可用于動物源性食品中β-受體阻斷劑的殘留檢測。

[1] Xu H，Zhang H W，Zhang G，Wang F M.J.Chin.Mass.Spectrom.Soc.(許輝，張鴻偉，張罡，王鳳美.質譜學報)，2015，2：1-8.

[2] Lü L.J.Pract.Med.Tech.(呂露.實用醫(yī)技雜志)，2006，13(9)：1603-1604.

[3] Wang L J.Chin.Med.Mod.Dis.Educ.Chin.(王麗娟.中國中醫(yī)藥現代遠程教育)，2010，8(9)：229.

[4] Pang G F.ModernTechniquesforResidueAnalysisofPesticideandVeterinaryDrugs.Beijing：Science Press(龐國芳.農藥獸藥殘留現代分析技術.北京：科學出版社),1999.

[5] Quan B Z，Huang R Y，Hua X B，Chen J L，Xie D P,Zhang S M，Shao Y.JiangxiJ.Anim.Husb.Veter.Med.(全炳昭，黃仁友，花象柏，陳鷺江，謝德麃，章壽民，邵瑩.江西畜牧獸醫(yī)雜志)，1996,1:16-19.[6] Miao H，Zou J H，Fan S，Gan L W，Zhao Y F，Wu Y N.Chin.J.Chormatogr.(苗虹，鄒建宏，范賽，甘樂文，趙云峰，吳永寧.色譜),2010，28(6):572-578.

[7] World Anti-Doping Agency.The World Anti-Doping Code：The 2015 Prohibited List.[2016-03-18].https://www.wada-ama.org/en/resources/science-medicine/prohibited-list.

[8] CAC/MRL 02-2005.Maximum Residue Limits for Veterinary Drugs in Foods.Codex Alimentarius Commission.

[9] Delahaut Ph，Levaux C，Eloy P，Dubois M.Anal.Chim.Acta，2003,483(1/2):335-340.

[10] Kamila M,Andrzej P，Jan Z.Anal.Chim.Acta，2009,637(1/2):185-192.

[11] Liu J J，Zhang J，Shao B，Li Q S.Res.Environ.Sci.(柳晉杰，張晶，邵兵，李青山.環(huán)境科學研究)，2009，22(7):862-867.

[12] Zhang J，Shao B，Yin J，Wu Y N，Duan H J.J.Chromatogr.B，2009，877(20/21)：1915-1922.

[13] Fan S，Miao H，Zhao Y F，Chen H J，Wu Y N.J.Agric.FoodChem.，2012，60(8):1898-1905.

[14] David M G，Francisco J L，Nikola J，Laura G G，Ana M G.Anal.Chim.Acta，2015,891:321-328.

[15] Meritxell G，Tania M P，Mira P，Maria J L A，Damia B.J.Chromatogr.A，2008,1189(1/2)：374-384.

[16] Wu Y N，Miao H，Fan S，Zhao Y F.Sci.Sin.:Chim.(吳永寧，苗虹，范賽，趙云峰.中國科學:化學)，2009，39(8):774-784.

Determination of Eleven β-Blocker Residues in Animal Derived Foods by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction

HAO Jie，JIANG Jie*，SHAO Rui-ting，DING Xue-yan，SHI Na，LU Yong

(Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring，Beijing 100041，China)

A molecularly imprinted solid phase extraction coupled with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric (UPLC-MS/MS) method was developed for the determination of eleven beta blocker residues in animal derived foods.The sample was enzymed withβ-glucuronidase/aryl sulfatase.The supernatant fraction was adjusted to the optimal pH value，and then extracted with isopropanol-ethyl acetate (5∶5，by volume).The organic solvent was first evaporated to dryness, and then redissolved，finally purified by molecularly imprinted solid phase extraction.The analyte was separated with a BEH C18column by gradient elution using methanol-5 mmol/L ammonium acetate (containing 0.1% formic acid) as mobile phase，and detected by MS under ESI+ ionization and multiple reactions monitoring mode.The quantification of the analytes was performed by the matrix standard addition method.The limits of detection and limits of quantitation were in the ranges of 0.02-0.1 μg/kg and 0.05-0.25 μg/kg，respectively.The calibration curves of 11β-blockers were linear in the range of 0.05- 10 μg/kg，with correlation coefficients not less than 0.991.Under three spiked levels，the average recoveries of the analytes in pork and liver were 73.2%-108.3% and 70.2%-98.2%，respectively，with relative standard deviations of 1.3%-9.5% and 3.7%-9.8%，respectively.The method is rapid，sensitive and precise，and is suitable for the determination ofβ-blocker multi residues in animal derived foods.

molecularly imprinted solid phase extraction；liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)；β-blocker；residue determination

2016-03-24；

2016-04-18

北京市科技計劃(Z161100000616007)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.010

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)10-1278-05

*通訊作者：姜 潔，博士，高級工程師，研究方向：食品安全，Tel：010-50959673，E-mail：jybjj2004@126.com