響應面法對3,5-二硝基水楊酸比色法測定水果中還原糖含量條件的優化

李志霞，聶繼云，閆 震，李 靜，匡立學，沈友明

(中國農業科學院果樹研究所，農業部果品質量安全風險評估實驗室(興城)，遼寧 興城 125100)

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響應面法對3,5-二硝基水楊酸比色法測定水果中還原糖含量條件的優化

李志霞，聶繼云*，閆 震，李 靜，匡立學，沈友明

(中國農業科學院果樹研究所，農業部果品質量安全風險評估實驗室(興城)，遼寧 興城 125100)

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定水果中還原糖的含量，在單因素試驗的基礎上，采用三因素三水平的響應面分析法(RSM)優化DNS法測定蘋果還原糖的最佳條件，同時建立數學模型并驗證其可靠性?；貧w方程失擬項不顯著(P=0.133 7)，預測值與實際值吻合(R2=0.957 4)；影響DNS法測定還原糖含量的因素主次順序為：DNS用量﹥反應溫度﹥顯色時間；DNS法測定還原糖含量的最佳條件為：DNS用量4.0 mL，顯色時間5.0 min，反應溫度87.0 ℃，測得還原糖實際濃度為94.66 mg/L，與理論預測值基本相符。按照優化的最佳條件，以蘋果、桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿6種代表性水果為對象驗證該方法的精密度、重復性和準確度，其標準偏差為0.1%～0.5%，相對標準偏差為2.0%～4.8%，加標回收率為90.6%～104.2%。該方法簡便、快速，準確度高，重現性好，適合于蘋果及其他水果中還原糖的測定。

還原糖；響應面法；3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法；優化；水果

隨著人們生活水平的提高，公眾對水果的消費需求日益增加。水果可以給人體提供糖類等必需營養物質，還可預防疾病、提高免疫力，有利于健康長壽[1-4]。糖類是水果的重要組成成分，研究表明，還原糖是水果中糖的主要類型，含量最高可占90%以上[5-7]。水果中的還原糖主要為葡萄糖和果糖，其種類及含量在果實營養價值和口感風味的形成過程中作出了重要貢獻。Crespo等[8]認為，果糖比葡萄糖口感更甜，假設蔗糖的甜度參考值為100%，果糖和葡萄糖的相對甜度值則分別為170.3%和74%。這與許多研究者采用的總甜度指數=[(1.00×蔗糖) + (0.76×葡萄糖) +(1.50×果糖)] 理論[9]基本一致。Zhang等[10]發現，在2個甜瓜品種成熟過程中，果糖對其甜度形成的貢獻最大。除影響水果品質外，還原糖在增強果實抗逆性、延長貯藏期等方面也發揮重要作用[11-13]。因此，建立準確快速測定水果中還原糖的實驗室方法極為重要。

對于還原糖的測定方法，國家標準[14]采用滴定法，但此法操作繁瑣，對滴定終點判斷要求高，不利于實驗室大量樣品的測定。3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)是半微量定糖法，操作簡便、快捷，雜質干擾較少，適合批量測定，是目前實驗室測定還原糖最常用的方法[15]。蘋果、桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿作為仁果類、核果類、漿果類、瓜果類、柑果類、熱帶水果的代表性果品種類，在我國乃至世界的產量均位列前茅[16]，研究并優化其還原糖測定方法具有顯著的代表性。本文以還原糖含量為考察指標，利用 Design-Expert V8.0.6 軟件中心組合設計，采用響應面分析法(Response surface method，RSM)優化DNS比色法測定蘋果中還原糖含量的條件，以期獲得最佳測定條件，從而為水果中還原糖的測定提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

U-3900型紫外-可見分光光度計(日本Hitachi高科公司)；HWS28型電熱數顯恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

葡萄糖(天津市科密歐化學試劑有限公司)；3,5-二硝基水楊酸(天津市光復精細化工研究所)；丙三醇、碳酸鈣、亞鐵氰化鉀(天津市風船化學試劑科技有限公司)；乙酸鋅(北京市旭東化工廠)；以上試劑均為分析純。實驗用水為蒸餾水。

供試水果樣品蘋果、油桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿均購于本地超市。

1.2 標準溶液制備與樣品還原糖的測定

1.2.1 葡萄糖標準曲線的制作與標準溶液單因素試驗 精確量取0.0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6 mL濃度為1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液于6支10 mL具塞刻度試管中，分別以水調節體積至2 mL，各加入3.0 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑并搖勻后，置于沸水中加熱5 min。取出后放入冷水中冷卻至室溫，定容，于540 nm波長處比色。所得葡萄糖的標準曲線回歸方程為y=149.3x+ 0.910 1(式中x表示吸光度，y表示葡萄糖濃度，mg/L)，吸光度與葡萄糖濃度之間呈良好的線性關系(r2=0.999 5)。

1.2.2 蘋果樣品中還原糖的測定 參照標準[17]方法進行。稱取10 g蘋果勻漿于燒杯中，加2 g CaCO3后用水轉移至250 mL容量瓶中，置于80 ℃水浴保溫30 min，取出后加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各3.3 mL以沉淀蛋白質等雜質，冷卻至室溫后用水定容，過濾。濾液按適當比例稀釋并定容后，吸取1 mL樣液進行測定。

1.3 試驗設計

1.3.1 單因素試驗 以還原糖含量為指標，分別考察DNS用量、顯色時間、反應溫度對蘋果樣品中還原糖濃度測定結果的影響。

1.3.2 RSM優化試驗 在單因素試驗的基礎上，根據中心組合設計(Central composite design)，采用軟件 Design Expert V8.0.6 建立3因素3水平的試驗，通過擬合二次多項式方程，確定DNS法測定還原糖的最佳條件。以還原糖濃度(mg/L)為考察指標，DNS用量、顯色時間和反應溫度為自變量，因素水平編碼見表1。

表1 試驗自變量因素編碼及水平

1.3.3 驗證與方法考察 通過軟件分析獲得最佳測定條件后，按照優化條件進行提取測定，驗證預測值的準確性。同時，按照優化的最佳測定條件，以不同材料驗證該方法的精密度、重復性和準確度，并考察了該方法與傳統滴定法測定結果之間的差異顯著性及其時間穩定性。

1.4 統計分析

采用DPS 7.05數據處理軟件的Duncan多重比較法(P<0.05)進行數據統計分析，EXCEL作圖。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 試劑用量對還原糖含量的影響 吸取2.0 mL提取樣液，分別以水作試劑空白，按照“1.2.1”方法考察了加入 不同DNS試劑用量(0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL)對還原糖含量測定的影響。結果顯示，隨著DNS用量的增加，測定的蘋果還原糖濃度逐漸升高，當用量超過3.0 mL后，還原糖濃度增幅變緩，差異不顯著。為了節省試劑，實驗選擇3.0 mL DNS為最佳試劑用量。

2.1.2 顯色時間對還原糖含量的影響 吸取2.0 mL提取樣液，以水做試劑空白，按照“1.2.1”方法分別考察1,3,5,7,10,15,20 min顯色時間對蘋果還原糖濃度的影響。結果表明，還原糖濃度隨著顯色時間的延長而逐漸升高，顯色5 min時還原糖濃度最大，超過5 min后，還原糖濃度無顯著變化。為保證反應穩定，選擇5 min為最佳顯色時間。

2.1.3 反應溫度對還原糖含量的影響 吸取2.0 mL提取樣液，以水作試劑空白，按照“1.2.1”方法分別考察了40,50,60,70,80,90,100 ℃反應溫度對蘋果還原糖濃度的影響。結果顯示，在40～100 ℃范圍內，隨著溫度的升高，還原糖濃度持續升高，當溫度超過80 ℃后，還原糖濃度趨于穩定，差異不顯著。為節約成本，選擇80 ℃為最佳反應溫度。

2.1.4 顯色溶液穩定性試驗 將蘋果、油桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿的樣品提取液按照“1.2.1”方法進行顯色反應后，于540 nm波長下立即比色，掃描0～120 min時間范圍內吸光度值的變化。結果顯示，6種水果樣液在顯色30 min后，吸光度值下降速率為2.0%～5.2%；顯色60 min后，下降速率為3.0%～9.9%；顯色120 min后，下降速率為5.0%～20.4%。其中以葡萄的穩定性最好，油桃的穩定性最差。因此，顯色溶液宜在30 min內測完，測定油桃樣品時應盡量快速完成。

2.2 RSM實驗設計方案與優化結果

2.2.1 設計方案與結果 在單因素試驗的基礎上，根據“1.3.2”設計方案，以RSM中心組合設計原理進行響應面試驗。RSM是一種有效的統計分析方法，通過實驗數據建立數學模型來實現受多因素影響的最優組合條件的篩選，其中，中心組合設計在食品工業中的應用較為廣泛[18-20]。根據中心組合設計原理對3個主要影響因素進行了3因素3水平共20個實驗點的響應分析試驗，實驗設計與結果如表2所示。結果顯示，試驗響應值與理論預測值基本相符。

表2 RSM實驗設計與結果

(續表2)

NumberIndependentvariablecodevalueIndependentvariablenoncodingvalueResponsevalue(mg/L)X1X2X3DNSamount/mLReactiontime/minReactiontemperature/℃TrialvaluePredictedvalue500-16835631880037908611-14670846686267-1-1-1247077047797800035809287912290168036688089588856101114690951195981100035809003912212000358089439122131-1-144708212829214168004685809406917415-1112690807781771600035809152912217-11-1267078987869181-1144909137934519-168001325807585756320000358091829122

表3 回歸模型的顯著性檢驗結果

2.2.3 各因素對還原糖含量的影響分析 用各因素的F值可評價該因素對試驗指標的影響，F值越大，表明該因素的影響越顯著。由表3可知，F(X1)=103.52，F(X2)=2.97，F(X3)=52.18，即用DNS法測定還原糖含量時，各因素的影響順序為DNS用量﹥反應溫度﹥顯色時間。

響應曲面的坡度變化及等高線形狀可以反映因素對還原糖含量影響的強弱程度及其交互作用。響應曲面坡度陡峭時，表明響應值對處理條件的變化非常敏感；相應曲面相對平緩則說明其可容忍處理條件的影響。同時等高線的形狀可反映出交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示兩因素交互作用可忽略[22]。考察了DNS用量、反應溫度、顯色時間對測定還原糖含量影響的響應曲面和等高線圖。結果顯示，DNS用量和反應溫度之間交互作用顯著，隨著用量增加和溫度升高，還原糖濃度逐漸增大，在用量增至3 mL和溫度升至80 ℃之后逐漸變緩(圖1)。

2.2.4 最佳測定條件及驗證實驗 由Design-Expert V8.0.6軟件分析得出最佳條件：DNS用量為3.94 mL，顯色時間為5.23 min，反應溫度為87.47 ℃，該條件下還原糖含量的理論濃度為96.03 mg/L。為檢驗該最佳測定條件的可靠性，進行了驗證實驗。考慮到實際操作的可行性，將測定條件改進為：DNS用量4.0 mL，顯色時間5.0 min，反應溫度87.0 ℃。通過3次平行實驗，測得最佳條件下還原糖的濃度為94.66 mg/L，與理論值的相對誤差僅為1.4%。因此，利用響應曲面法優化DNS比色法測定還原糖的最佳條件是可行的。

2.3 優化方法的精密度、重復性及準確度

利用響應曲面法優化后的條件對蘋果、油桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿中還原糖含量進行測定，考察方法的精密度、重復性和準確度。分別吸取樣液按照優化后方法連續測定9次，根據測定結果分別計算標準偏差(SD)和相對標準偏差；測得標準偏差為0.1%～0.5%，表明該方法精密度良好；相對標準偏差為2.0%～4.8%，均低于5.0%，表明該方法的重復性良好。

按照6種水果的還原糖含量，分別添加約0.5，1.0，2.0倍3個梯度(相當于樣品還原糖含量)的葡萄糖后，計算其回收率，結果見表4。還原糖的回收率為90.6%～104.2%，表明該方法準確度良好。

表4 回收率測定結果

2.4 DNS法與滴定法測定結果的比較

采用國家標準方法[14]中的滴定法對蘋果、油桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿中的還原糖含量進行測定，重復測定3次；同時從“2.3”的9次測定結果中隨機選取3次，比較2種方法測定結果的差異顯著性(表5)。由表5可以看出，除油桃外，采用2種方法測定的還原糖含量均無顯著性差異。分析原因，可能是由于油桃中的還原糖含量偏低，采用滴定法測定時誤差較大。滴定法測定還原糖時，對滴定液體積的要求較為嚴格，需控制在10 mL左右，否則誤差較大[14]。本實驗采用滴定法測定油桃中還原糖含量時滴定體積超過20 mL，測定結果應以DNS法為準。

表5 DNS法與滴定法測定6種水果中還原糖含量的比較

3 結 論

本文在單因素實驗的基礎上，采用中心組合設計及響應面分析，建立了DNS試劑用量、顯色時間以及反應溫度對水果中還原糖含量影響的回歸模型，該回歸模型R2=0.957 4，失擬項P=0.133 7﹥0.05，說明該模型與實際情況擬合良好。在試驗設計范圍內，影響DNS法測定還原糖含量的各因素，其影響順序分別為：DNS用量﹥反應溫度﹥顯色時間。最佳條件為：DNS用量4.0 mL、顯色時間5.0 min、反應溫度87.0 ℃，按照優化的最佳條件，以蘋果、桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿6種水果驗證該方法的精密度、重復性和準確度，其標準偏差為 0.1%～0.5%；相對標準偏差為2.0%～4.8%；回收率為90.6%～104.2%，方法的精密度、重復性和準確度良好。除油桃外，其他5種水果的測定結果與傳統滴定法的測定結果無顯著差異。該方法為水果中還原糖含量的測定提供了依據。

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Optimization of 3,5-Dinitrosalicylic Acid Colorimetry Determination Conditions of Reducing Sugar in Fruits by Response Surface Method

LI Zhi-xia，NIE Ji-yun*，YAN Zhen，LI Jing，KUANG Li-xue，SHEN You-ming

(Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Fruit(Xingcheng)，Ministry of Agriculture，Institute of Pomology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Xingcheng 125100，China)

The optimum reducing sugar determination conditions of 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry(DNS colorimetry) were investigated using the Response Surface Method(RSM).The reducing sugar content in apple was obtained under the optimum extraction conditions.Based on the results of the single factor experiments，an optimization procedure was carried out in order to investigate the effects of key parameters on reducing sugar determination.Optimization was conducted using a Central Composite Design(CCD) with three key factors of DNS amount，reaction temperature and coloration time.The quadratic term model of the determination conditions was established and the reliability was checked.The results of regression analysis presented a non-significant lack of fit(P=0.133 7) and a high coefficient of determination value(R2) of 0.957 4 for the response surface model,which showed a satisfactory agreement of the polynomial regression equation with experimental data.The influence of three factors followed the sequence as：DNS amount > reaction temperature > coloration time.The optimum determination conditions of reducing sugar using DNS colorimetry were DNS amount：4.0 mL，coloration time：5.0 min，reaction temperature：87.0 ℃.The actual concentration of reducing sugar was obtained to be 94.66 mg/L,which was consistent with the theory predicts under the optimal conditions.According to the optimum determination conditions，the precision，repeatability and accuracy of the method were verified using apple，peach，grape，hami melon，navel orange and pineapple as representative fruits.The standard deviations，relative standard deviations and recoveries of the reducing sugar contents in the 6 fruit species were in the range of 0.1%-0.5%，2.0%-4.8%，90.6%-104.2%，respectively.The study provided a reliable method for accurate，efficient and cost-effective detection of reducing sugar contents in fruits.

reducing sugar;response surface methodology(RSM);3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) colorimetry;optimization;fruit

2016-03-28；

2016-04-25

農業部農業行業標準制修訂專項(2014301)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(0032014013)；中國農業科學院科技創新工程項目(CAAS-ASTIP)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.011

O657.3;O629.1

A

1004-4957(2016)10-1283-06

*通訊作者：聶繼云，博士，研究員，研究方向：果品質量與安全，Tel：0429-3598178，E-mail：niejiyun@caas.cn