基于高通量測序技術無創篩查雙胎染色體非整倍體及胎兒游離DNA濃度分析

許旭平 謝美娟 甘海燕 梁榮良 韓爾康 楊學習 吳英松★

·論著·

基于高通量測序技術無創篩查雙胎染色體非整倍體及胎兒游離DNA濃度分析

許旭平1謝美娟1甘海燕2梁榮良1韓爾康2楊學習1吳英松1★

目的評估無創高通量測序方法篩查雙胎染色體非整倍體的可行性，并對胎兒游離DNA濃度進行分析。方法收集雙胎妊娠樣本120例，包括自然雙胎67例，輔助生殖技術植入的雙胎47例，雙胎消失綜合征樣本6例，并收集68例單胎樣本作為對照，采用無創高通量測序方法進行檢測。通過Z值進行陰性和陽性判斷，根據Y染色體唯一比對條數進行胎兒游離DNA濃度計算，并對三體陽性樣本進行核型分析。結果本次實驗篩查出2例雙胎染色體三體陽性樣本，分別為正常/21三體和13三體/18三體，均與核型結果一致。自然雙胎妊娠組胎兒游離DNA濃度明顯高于輔助生殖技術植入雙胎組、雙胎消失綜合征組和自然妊娠單胎組，P值均小于0.05。其他3組間胎兒游離DNA濃度無顯著性差異。結論采用無創高通量測序方法進行雙胎妊娠染色體非整倍體篩查也是可行的，同時結果分析應該考慮胎兒游離DNA濃度的影響。

無創產前篩查；雙胎；染色體非整倍體；高通量測序；胎兒游離DNA濃度

胎兒游離DNA的發現［1］為無創產前篩查提供了新思路，并且大量臨床研究證實高通量測序技術在無創產前篩查中的可行性及優勢［2?5］。近2年，隨著高通量測序技術的迅猛發展，利用高通量測序技術進行無創產前檢測（non?invasive prenatal teast?ing，NIPT）篩查常見染色體的非整倍體日益受到人們的關注，并以其具有非侵入和準確的特點在各大醫院得到了陸續開展。目前國內外學者對無創產前篩查的準確性和可行性評估，主要是針對單胎妊娠孕婦而進行的。雖然Audibert［6］和Huang等［7］分別對加拿大人群和中國人群進行了無創產前篩查21和18三體雙胎孕婦適用性研究，但是對雙胎妊娠孕婦群體的適用性相關研究和報道仍然比較少。因此本研究利用高通量測序技術對雙胎妊娠樣本進行無創產前篩查，以評估其篩查雙胎染色體非整倍體的可行性，并對雙胎樣本胎兒游離DNA濃度進行分析來評估它對雙胎樣本的無創產前篩查的影響。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2014年12月至2015年11月于達安健康臨檢中心（廣東省廣州市）做無創產前篩查的150例中68例懷有男性胎兒的單胎樣本作為對照組，217例雙胎妊娠中的120例懷有男性胎兒的孕婦樣本實驗組進行分析，其中包括自然雙胎67例，輔助生殖技術植入的雙胎47例，雙胎消失綜合征樣本6例。孕婦在采血前均已簽署知情同意書并在申請無創產前篩查前均已進行血清學和超聲學的檢查，且結果提示為高風險。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及血漿分離

用無菌的EDTA抗凝管采集孕婦外周血10 m L。先4 300 rpm低速離心10m in，將上清液轉移到無菌的低吸附Eppendorf管內，接著13 600 rpm， 4℃，高速離心10m in［8］，吸取上層血漿并分裝到新的Eppendorf管內，凍存于-80℃冰箱。

1.2.2 血漿中游離DNA提取

血漿游離DNA采用金麥格血清游離DNA提取試劑盒（磁珠法）（GenMag，北京），按照說明書進行提取。

1.2.3 測序文庫構建

文庫構建采用Ion Plus Fragment Library KitV3和Ion Plus Fragment Library Adapters Kit（Life，美國），并按照說明書操作。文庫構建好后采用Qu?bit?2.0和dsDNA HSAssay Kit測定濃度，用安捷倫的2100 bioanalyzer（Agilent，美國）檢測DNA片段分布情況。

1.2.4 測序

文庫采用Ion OneTouch?2儀器進行模板制備，然后使用Ion OneTouch?ES儀器進行陽性模板富集，接著采用Proton測序儀進行上機測序，試劑采用Ion PI?Sequencing 200 Kit v3，芯片為Ion PI?Chip v2（life，美國），并按照說明書進行操作。

1.2.5 核型分析

測序分析結果為染色體三體陽性的樣本，通過告知孕婦三體高風險情況并征求孕婦同意下在醫院進行羊水穿刺，并將穿刺物送第三方檢測機構進行羊水細胞培養染色體核型分析。

1.2.6 數據分析

測序數據經去低質量、去重復、GC校正等處理后，根據類似文獻報道的方法［9］分別計算出13號染色體，18號染色體和21號染色體的Z值，并以Z值＞3判斷為該染色體三體陽性。根據Y染色體唯一比對條數進行胎兒游離DNA濃度計算［10］。采用SPSS 19.0軟件進行結果統計，運用單因素方差分析比較自然妊娠雙胎組、輔助生殖技術植入的雙胎組、雙胎消失綜合征組和單胎妊娠組4組間胎兒游離DNA濃度、孕周、孕婦年齡和Z值的差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣本基本情況分析

188例樣本按妊娠情況分成4組，其中自然妊娠雙胎組樣本67例，孕婦平均年齡為30.39周歲，平均孕周為17.96周；輔助生殖技術植入雙胎組樣本47例，孕婦平均年齡為32.30周歲，平均孕周為17.64周；雙胎消失綜合征組樣本6例，孕婦平均年齡為31.83周歲，平均孕周為16.33周；自然妊娠單胎組樣本68例，孕婦平均年齡為31.51周歲，平均孕周為17.84周；單因素方差分析結果顯示，4組間孕婦年齡間無顯著性差異（F=1.124，P=0.341），孕周間也未見顯著性差異（F=0.268，P=0.848）。

2.2 雙胎妊娠染色體非整倍體檢出情況

120例雙胎妊娠樣本中，一共檢出2例染色體三體陽性樣本，陽性率約為1.7％，其中一例為自然妊娠，測序結果為21三體陽性；另一例為輔助生殖技術植入的樣本，測序結果為13三體和18三體陽性。陽性檢出結果與后續的核型分析結果一致，具體情況見表1。另外，病例跟蹤結果顯示，本次研究所檢測的陰性樣本中未出現假陰性的案例。

表1 2例染色體三體陽性雙胎妊娠樣本檢測結果Table 1 Resultsof 2 casesof trisomy in tw in pregnancies

2.3 胎兒游離DNA濃度分析

自然妊娠雙胎組樣本平均的胎兒游離DNA濃度為14.72％；輔助生殖技術植入雙胎組樣本平均的胎兒游離DNA濃度為11.25％；雙胎消失綜合征組樣本平均的胎兒游離DNA濃度為11.51％；自然妊娠單胎組樣本平均的胎兒游離DNA濃度為11.26％，見表2。單因素方差分析結果顯示，4組間胎兒游離DNA濃度具有顯著差異，F=13.864，P=0.000。組間兩兩比較分析顯示，自然雙胎妊娠組胎兒游離DNA濃度明顯高于輔助生殖技術植入雙胎組、雙胎消失綜合征組和自然妊娠單胎組，P值均小于0.05。而其他3組間胎兒游離DNA濃度無顯著性差異（圖1）。

表2 4組間胎兒游離DNA濃度比較Table 2 Fetal DNA fractions of 4 groupsw ith different conceptions

2.4 染色體Z值

單因素方差分析結果顯示，自然雙胎妊娠組、輔助生殖技術植入雙胎組、雙胎消失綜合征組和自然妊娠單胎組4個組間13號、18號和21號染色體的Z值均無顯著性差異（F13=0.268，P13=0.848；F18=0.412，P18=0.744；F21=0.745，P21=0.526）。

3 討論

自Lo等［1］發現孕婦血漿中存在胎兒游離DNA后，國內外研究人員針對胎兒游離DNA進行了許多理化性質的研究［11?13］，尤其是在促進無創產前診斷（NIPT）方面取得了突破性的進展［14?15］。近

年來隨著高通量測序技術的快速發展，測序儀的不斷升級換代，以及配套的分析軟件和生物信息學的進步，國家政策的支持等，高通量測序篩查常見染色體非整倍體已經初步走進了臨床實際運用。高通量測序篩查常見染色體非整倍體具有非侵入性、準確性高，又快速的優點［14，16?17］，受到了孕婦和醫院的青睞，并在我國大型醫院陸續得到開展。而國內外學者主要是針對單胎妊娠孕婦進行了無創產前篩查的準確性和可行性評估，而針對雙胎妊娠孕婦群體的研究和運用仍然比較少且并未成熟。本研究利用高通量測序技術對雙胎妊娠樣本進行了無創產前篩查雙胎染色體非整倍體，并成功篩查出2例染色體三體陽性樣本。同時我們的研究結果也顯示自然雙胎妊娠組、輔助生殖技術植入雙胎組、雙胎消失綜合征單胎組和自然妊娠單胎組4個組間13號、18號和21號染色體的Z值均無顯著性差異，即雙胎妊娠時對染色體三體的判斷值（Z值）造成影響并不大。這在一定程度上說明高通量測序技術篩查常見染色體非整倍體對雙胎妊娠樣本同樣適用。

自然狀態下雙胎妊娠的概率約為1/90，由于孕婦年齡的增加，近年來醫源性促排卵藥物的使用，以及避孕藥的使用等使得我國雙胎妊娠呈現增高的趨勢［18?20］，平均可達2％。而高齡孕婦懷有染色體非整倍體胎兒的幾率高于正常育齡的孕婦。我國全面放開二胎，高齡孕婦可能會進一步增加。另外輔助生殖技術讓不孕不育患者看到了希望，為保證存活率一般都植入2個胚胎，這也人為地增加了雙胎妊娠的比例。雙胎妊娠發生染色體非整倍體的風險也高于單胎妊娠［21］。因此加快促進高通量測序技術篩查雙胎染色體非整倍體技術的成熟顯得尤為重要。

本次研究篩查出一例一胎為21三體而另一胎為正常胎兒的自然妊娠雙胎樣本，該病例可能是由于單合子分裂后染色體不分離導致。針對此類情況，孕婦經核型確診后可以選擇實施選擇性減胎術而避免三體患兒的出生。本研究還檢出1例輔助生殖技術植入雙胎染色體三體陽性樣本，占總輔助生殖技術植入的雙胎樣本的2.1％。該樣本同時發生了13三體和18三體陽性現象，經核型分析確診該雙胎病例為一胎患有13三體，另一胎患有18三體。該現象提示我們輔助生殖技術植入的雙胎患染色體非整倍體的概率可能要高于正常妊娠的孕婦。這可能跟進行輔助生殖技術植入人群的特點有關，但仍然需要更多的研究數據來支持，我們后續將會對該現象做進一步的深入研究。

雖然當我們檢測出雙胎發生三體陽性時，還未能通過NIPT來判斷是其中一個胎兒發生了染色體三體還是2個胎兒都發生了染色體三體，也還未能區分到底是哪一個胎兒發生了三體，但是我們可以減少對陰性樣本進行羊水穿刺而給孕婦帶來的痛苦和流產風險。

雖然高通量測序技術篩查染色體非整倍體具有很多優點，但也無法回避其受胎兒游離DNA濃度影響這一事實。目前研究發現無創產前篩查的判斷值（Z值）受母體血漿中胎兒游離DNA濃度的影響且呈現一定的線性關系［22］。但胎兒游離DNA濃度低于4％時，NIPT的檢測結果很容易出現假陰性［23］。本研究發現自然雙胎妊娠組胎兒游離DNA濃度要明顯高于輔助生殖技術植入雙胎組、雙胎消失綜合征單胎組和自然妊娠單胎組，因此在進NIPT結果分析時，應當考慮胎兒DNA濃度所帶來的影響，還應對孕婦的不同妊娠情況加以考慮，并根據不同情況作出相應的分析策略調整和結果校正。自然雙胎妊娠組胎兒游離DNA濃度要明顯高于輔助生殖技術植入雙胎組這個可能是由于兩者的孕周計算發生不同或者是輔助生殖技術植入的胚胎在孕婦體內生長發育速度不同于同期大小的自然妊娠的雙胎而造成的。其中還觀察到雙胎消失綜合征單胎組和自然妊娠單胎組間胎兒游離DNA濃度不存在顯著性的差異，這說明胎兒消失后其游離在母體內的DNA會被迅速清除而不會對繼續發育的另一胎兒造成影響，

因此這對該類型的孕婦，仍然可以采取高通量測序方法來篩查染色體非整倍體。

綜上所述，采用無創高通量測序方法進行雙胎妊娠染色體非整倍體篩查也是可行的，同時在進行結果分析應該考慮胎兒游離DNA濃度的影響。

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Noninvasive prenatal testing for aneup loidy by next generation sequencing of maternal p lasma DNA in tw in pregnancies and its fetal free DNA fraction analysis

XU Xuping1，XIE Meijuan1，GAN Haiyan2，LIANG Rongliang1，HAN Erkang2，YANG Xuexi1，WU Yingsong1★
（1.School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515；2.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou，Guangdong，China，510665）

Objective To investigate the feasibility of screening aneuploidy by next generation sequencing of maternal plasma DNA in tw in pregnancies and analyzing the fetal free DNA fractions. Methods The data came from 120 casesof tw in pregnancies,including 67 natural tw in pregnancies,and 47 in vitro fertilization（IVF）assisted pregnancies as well as 6 vanishing tw in syndromes.68 cases of singleton pregnancies were also recruited.All cases underwent noninvasive prenatal testing for aneuploidy by next generation sequencing of maternal plasma DNA.The Z score was calculated to determine aneuploidies for chromosomes 21,18 and 13.The fetal free DNA fractionswere determined by calculating the proportion of Y chromosomal unique reads.Results Therewere 1 case of trisomy 21(one normal and the other trisomy 21) and 1 case of both trisomy 13 and trisomy 18(one trisomy 13 and the other trisomy 18)confirmed by karyotyping among tw in pregnancies.The fetal free DNA fractions of natural tw in pregnancies were

Noninvasive prenatal testing;Tw ins;Chromosome aneuploidy;Next generation sequencing;Fetal free DNA fraction

廣東省科技計劃應用型科技研發專項（2015B020233009）；廣東省科技計劃能力建設項目（2015A030401040）

1.南方醫科大學檢驗與生物技術學院，廣東，廣州510515 2.廣州市達瑞生物技術股份有限公司，廣東，廣州510665

★通訊作者：吳英松，E?mail：wg@smu.edu.cn

significantly higher than IVF assisted pregnancies,vanishing tw in pregnancies and singleton pregnancies(P＜0.05)．There were no significant differences for fetal free DNA fractions among the latter 3 kinds of pregnancies.Conclusion Itwas feasible to screen chromosome aneuploidy by nextgeneration sequencing of maternal plasma DNA in tw in pregnancies,and itneeds to take fetal free DNA fraction into account during the resultanalysis.