不同品系栝樓果皮腺嘌呤和鳥苷含量比較

于京平 張永清

摘要：目的 比較不同品系栝樓果皮腺嘌呤、鳥苷含量，為選育良種和評價瓜蔞皮藥材質量提供依據。方法 采用高效液相色譜法測定3個品系栝樓果皮中腺嘌呤、鳥苷的含量，色譜柱為Waters AtlantisT3-C18（4.6 mm×150.0 mm，5 ?m），流動相為甲醇-水，檢測波長254 nm。結果 品系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ栝樓果皮腺嘌呤含量分別為0.159 4、0.159 6、0.134 1 mg/g，鳥苷含量分別為0.097 1、0.127 9、0.093 4 mg/g。結論 不同品系栝樓果皮鳥苷含量存在較大差異，以品系Ⅱ果皮中的腺嘌呤、鳥苷含量較高，提示選育良種是提高瓜蔞皮藥材腺嘌呤、鳥苷含量的有效途徑。

關鍵詞：高效液相色譜法；栝樓；果皮；腺嘌呤；鳥苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.021

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）09-0087-03

Comparison of Contents of Adenine and Guanosine in Peels of Three Strains of Trichosanthes kirilowii Maxim. YU Jing-ping1， ZHANG Yong-qing2 （1. Binzhou Medical University， Yantai 264003， China； 2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

Abstract： Objective To compare the contents of guanosine and adenine in peels of three strains of Trichosanthes kirilowii Maxim.； To provide references for germplasm resources evaluation and breeding of the Chinese medicinal materials. Methods HPLC method was used to determine the contents of guanosine and adenine with Waters AtlantisT3-C18 column （4.6 mm×150.0 mm， 5 ?m）. The mobile phase was methanol and water， and the detection wavelength was 254 nm. Results The contents of guanosinein in peels of three strains of Trichosanthes kirilowii Maxim. were 0.159 4， 0.159 6， 0.134 1 mg/g， respectively； the contents of adenine were 0.097 1， 0.127 9， 0.093 4 mg/g， respectively. Conclusion There were significient differences in the contents of adenine among three strains of Trichosanthes kirilowii Maxim.. Strain Ⅱ is with higher level of guanosine and adenine， which implies that the breeding of the Chinese medicinal materals is one way to improve the quality of Trichosanthis Exocarpium.

Key words： HPLC； Trichosanthes kirilowii Maxim.； peel； guanosine； adenine

栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.為葫蘆科多年生草質藤本植物，其干燥成熟果皮是常用中藥瓜蔞皮，可清熱化痰、利氣寬胸，具有調節脂代謝、抗動脈粥樣硬化、保護血管內皮、提高心肌抗缺氧能力、缺血再灌注損傷保護和鈣拮抗等藥理作用，用于治療心、腦、肺等多臟器的多種疾病，尤以治療動脈粥樣硬化引起的缺血性疾病為著[1-2]。有關瓜蔞皮的活性成分至今不明確，2015年版《中華人民共和國藥典》僅收載了以對照藥材薄層定性的鑒別方法，控制瓜蔞

基金項目：山東省科技發展計劃（2008GG2NS02022）；山東省農業良種工程（2009LZ01-03）；濟南市科技局高校院所自主創新項目（200906028）；濱州醫學院科研啟動基金項目（BY2014KYQD29）

皮藥材質量尚缺乏合理指標。以瓜蔞皮為原料研制生產的瓜蔞皮注射液具有行氣除滿、開胸除痹功效，用于治療冠心病心絞痛、腦梗死等[3-4]。腺嘌呤和鳥苷是瓜蔞皮注射液的主要成分，前者可提高紅細胞攜氧和放氧能力，與磷酸的結合物可刺激白細胞增生，用于防治白細胞減少癥[5]；后者可改善心腦血液循環，具有防止心率失常、抗腫瘤、抗病毒等活性[6-7]。因此，在活性成分尚不明確的情況下，可以將腺嘌呤、鳥苷含量作為瓜蔞皮藥材質量的控制指標。

山東省濟南市長清區是瓜蔞的道地產區，種植歷史悠久，藥材質量上乘。由于栝樓屬于雌雄異株植物，長期以來生產中種質混亂[8-9]。為了選育良種，實現提高產量、穩定質量的目標，我們經過廣泛收集與比較，將當地栝樓種質資源劃分為3個品系，并對不同品系果實與種子性狀、果皮無機元素及揮發性物質等進行了分析測定[10-12]。本研究采用HPLC測定3個品系栝樓果皮中的腺嘌呤與鳥苷含量，旨在為栝樓良種選育和瓜蔞皮藥材質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Agilent1200，美國Agilent），Waters AtlantisT3-C18色譜柱（4.6 mm×150.0 mm，5 ?m），超聲儀（KQ-300E，昆山市超聲儀器有限公司），電子天平（FA1104，上海天平儀器廠）。

栝樓果皮樣品采自濟南市長清區馬山鎮北李村，經山東中醫藥大學張永清教授鑒定為葫蘆科栝樓屬植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥果皮。腺嘌呤對照品（批號050302，上海伯奧生物科技有限公司），鳥苷對照品（批號26-2006，上海中藥標準化中心）；甲醇為色譜純（美國Tedia公司）；水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取一定量減壓干燥至恒重的鳥苷、腺嘌呤對照品，加水溶解，轉移至20 mL容量瓶中，定容，混勻，配制成腺嘌呤、鳥苷濃度分別為0.029 4、0.070 4 mg/mL對照品溶液，用0.45 ?m濾膜過濾，取續濾液，備用。

2.1.2 供試品溶液 將不同品系栝樓果皮置55 ℃條件下烘干，粉碎，過四號篩。四分法取樣，精密稱定適量干燥粉末，置具塞瓶中，加15%甲醇10 mL，稱定質量，50 ℃溫浸1 h，50 ℃超聲提取1 h（功率250 W，頻率40 kHz），冷卻，用15%甲醇補足減失的質量，4500 r/min離心10 min，取上清液，重復提取2次，合并上清液，用0.45 ?m濾膜過濾，即得。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters AtlantisT3-C18（4.6 mm×150.0 mm，5 ?m）；流動相：甲醇-水梯度洗脫（見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫為室溫；進樣量：50 ?L。色譜圖見圖1。

2.3 線性關系考察

精密吸取“2.1.1”項下鳥苷對照品溶液，分別加水稀釋至25、10、8、5、4、2.5倍，搖勻，按“2.2”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品進樣量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線，線性方程為Y=2 600 000X-1.218 7，r2=1.000 0。結果表明，鳥苷在0.148～1.408 ?g范圍內線性關系良好。

精密吸取“2.1.1”項下腺嘌呤對照品溶液，分別加水稀釋至100、50、20、10、1倍，搖勻，按“2.2”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品進樣量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線，線性方程為Y=5 000 000X+1.162 7，r2=0.999 7。結果表明，腺嘌呤在0.014 7～1.47 ?g范圍內線性關系良好。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件，測定腺嘌呤、鳥苷峰面積，重復5次，其峰面積RSD分別為0.47%、0.70%，表明精密度良好。

2.5 穩定性試驗

精密吸取供試品溶液，在2、4、6、8、10 h內測定腺嘌呤、鳥苷峰面積5次，其峰面積RSD值分別為2.12%、3.12%，表明供試品溶液在10 h內穩定。

2.6 重復性試驗

精密稱取栝樓果皮樣品，按“2.1.2”項下方法制備5份，分別測定腺嘌呤、鳥苷含量，均RSD<2.00%，表明重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱量已知鳥苷、腺嘌呤含量的樣品共6份，分別加入一定量的對照品，按“2.1.2”項下方法制備，按“2.2”項下色譜條件測定鳥苷、腺嘌呤含量，計算回收率，結果鳥苷、腺嘌呤的平均回收率分別為101.20%、100.67%，RSD分別為0.63%、0.91%，見表2、表3。表明對照品回收率符合要求。

2.8 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液50 ?L，按上述色譜條件測定其峰面積積分值，以外標法計算鳥苷、腺嘌呤含量，重復3次。色譜圖見圖2，鳥苷、腺嘌呤色譜峰峰形較好，分離良好，保留時間分別為20.758、28.586 min。含量測定結果見表4。品系Ⅰ、Ⅱ栝樓果皮腺嘌呤含量相近，均顯著高于品系Ⅲ；品系Ⅰ、Ⅲ栝樓果皮鳥苷含量相近，均顯著低于品系Ⅱ。

3 討論

在檢測波長的選擇上，本試驗對一定濃度的混合對照品溶液進行紫外掃描，結果254 nm為鳥苷的最大吸收波長，260 nm為腺嘌呤的最大吸收波長；與260 nm比較，波長254 nm檢測時基線平穩、峰形較好，鳥苷具有較高的響應值，腺嘌呤響應值差距不大；因此選取254 nm作為檢測波長。

本研究對超聲提取和回流提取得到的2種供試品溶液進行HPLC測定，結果超聲提取對栝蔞果皮中腺嘌呤、鳥苷的提取更為完全。超聲提取適用于熱穩定性較差、易高溫破壞的核苷類成分提取，同時能夠提高破碎速度，顯著提高提取效率，平行操作性強。因此，初步選擇超聲提取作為瓜蔞皮藥材核苷類成分HPLC含量測定的提取方式。

由于瓜蔞皮的活性成分至今尚不明確，其質量難以控制。本研究建立的HPLC方法，不僅能夠使瓜蔞皮提取液中各組分達到有效分離，而且還能在同一色譜條件下同時測定腺嘌呤和鳥苷含量，為有效控制瓜蔞皮藥材質量提供了新的途徑和方法。測定結果顯示，3個品系栝樓果皮鳥苷含量差異顯著，以品系Ⅱ含量較高，提示可以通過良種選育來提高和保證瓜蔞皮藥材的質量。雖然依據腺嘌呤和鳥苷含量可在一定程度上評價瓜蔞皮藥材品質，但由于瓜蔞皮化學成分復雜，發揮臨床療效的成分種類可能有多種，因此，更加合理與完備的評價方法仍需深入研究。

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