受滅鮭氣單胞菌感染的大西洋鮭編碼的可溶性TLR5轉錄編碼鑒定

胡 青 劉 敏

(西華大學外國語學院 四川 成都 610000)

受滅鮭氣單胞菌感染的大西洋鮭編碼的可溶性TLR5轉錄編碼鑒定

胡 青 劉 敏

(西華大學外國語學院 四川 成都 610000)

本文翻譯自Elseviers收錄文章Identification of a transcript encoding a soluble formof toll-like receptor 5(TLR5)in Atlantic salmonduring Aeromonas salmonicida infection

脊椎動物和昆蟲的Toll樣受體(TLRs)在先天免疫應答中與抗微生物病原相關。TLR的胞外區識別病原相關分子模式，胞內區啟動免疫反應的信號途徑。在染病大西洋鮭肝臟中發現一種新可溶性TLR轉錄物。BLASTN分析顯示其與最近在虹鱒中發現的可溶性TLR5(Genebank：AB062504)具有最高序列相似度。推導出蛋白質與哺乳動物TLR5對應的類富含亮氨酸區域(LRR)有40%的相似度。依照人類TLRs結構，它含21個LRRs保守區域，LxxLxLxxNx*xx*xxxxFxxL模式。由于TLR5可識別細菌鞭毛蛋白，可推測，滅鮭氣單胞菌鞭毛蛋白或其他一些配體衍生物與LRR中某區域結合到這種可溶性TLR。

可溶性Toll樣受體(TLR);亮氨酸富集重復(LRR);炎癥;大西洋鮭

先天免疫系統是抵抗病原體的首個防線，TLRs是其中識別病原體不可缺的部分。TLRs識別入侵的病原體保守的病原相關分子模式，繼而通過相互作用的幾個信號轉導通路引起宿主細胞的炎癥反應和免疫反應。其功能性研究多限于哺乳動物膜結合TLRs的胞外區。在河豚和虹鱒中也發現了sTLR5。本文研究在感染滅鮭氣單胞菌的大西洋鮭中的sTLR的核苷酸序列以及氨基酸序列，它與哺乳動物的TLR5相似，有21個LRR結構域，及LRR結構域中可能的配體識別位點。

從感染滅鮭氣單胞菌的大西洋鮭的肝臟SSHcDNA文庫中分離出了組裝哺乳動物TLR5胞外域的3種EST克隆(Genebank：BQ036495，BQ036497，BQ036528)。這些不完整的TLR序列都小于600bp，編碼不完整的TLR。為了獲得TLR完整的編碼區域，用RNeasy Maxi Kit從感染的大西洋鮭的肝臟中提取總RNA,用SMARTcDNA Library Construction Kit構建cDNA文庫。用雙重PCR擴增。第一重PCR：側翼插入引物(5‘-CAACTTGAACAGCGTCTATCTAT-3‘)和pTriplEx引物(5‘-CGCCCTATAGTGAGTCGTA-3‘)，退火溫度55℃，90s，40個循環。第二重PCR：基因特異性引物(5‘-GGGATATCAAGCATTTACAGGAC-3‘)和pTriplEx引物，退火溫度58℃，45s，35個循環。對終產物進一步的測序，發現這種特別的TLR沒有跨膜或胞質結構域。為得到5‘端的編碼區，根據虹鱒的TLR5(AB062504)設計引物。用正向基因特異性引物(5‘-CAAGCTGTAAACACATTCTTTATG-3’)和反向引物(5’-CTCTATAGACATGTTTCTAAAC-3’)進行PCR擴增。擴增產物用TA cloning kit(Invitrogen)克隆進pCR2.1載體，再利用ABI PRISM BigDye Terminator Ready Reaction mix and Model 2700 PCR System Thermal進行PCR循環測序。蛋白質的BLASTX分析顯示：其與哺乳動物對應的TLR5的胞外域有40%的相似性。

所得sTLR的cDNA序列全長2274bp，包括21bp的5‘非翻譯區，1992bp的開放讀碼框，編碼664個氨基酸殘基，以及258bp的3‘非翻譯區。前28個氨基酸殘基構成一個單肽，其后富含脯氨酸的區域(圖1下劃線)以及富含亮氨酸(LRR)的重復區域。利用哺乳動物TLRs的LRR一致序列(xLxxLxLxxNx*xx*xxxxFxxLxxx，x代表任意氨基酸，*代表疏水的氨基酸)來鑒定大西洋鮭LRRs，發現其有21個LRR區域。C末端的序列是以一致的LRR結構域開始，其后是近50個氨基酸殘基包括4個特殊構造的半胱氨酸殘基xLxxLxLxxNxFxCxCx(24-26)Cx(18-21)C。大西洋鮭中的這種sTLR僅2個半胱氨酸殘基是保守的。多數沒有跨膜結構或TIR結構域的sTLR5也適用于這種情況。哺乳動物的mTLR5的四個半胱氨酸殘基都用于維持C端的穩定性并保持整個胞外域靠近細胞膜。

LRR特征序列最初發現于人類血清基本結構，富含亮氨酸的α2糖蛋白，有24個氨基酸殘基重復序列和特殊構造的疏水殘基。大西洋鮭sTLR5含21個LRRs。除LRR7、9和18具有較大插入序列外，大西洋鮭sTLR的大多數LRRs組裝與哺乳動物TLR-LRR是一致特征序列。在哺乳動物TLR4、5、7、8和9中，插入序列是常見現象，這對PAMP的識別是至關重要的。至今未知，LRR7、9和18的插入序列是否會影響大西洋鮭sTLR5配體結合微生物毒力因子。

與mTLR5s不同，這種特殊的sTLR5最早報道于河鲀基因組。它在與mTLR5不同染色體上的一個稀有基因編碼的。在虹鱒中發現mTLR5和sTLR5有81%的相似性。用虹鱒肝瘤細胞系RTH-149，用鰻利斯頓氏菌或mTLR5的其他配體來刺激mTLR5，sTLR5的表達上調。人類TLR5的配體識別位點已定位于LRR特征序列，第386-407個氨基酸之間，LRR14中。鮭科魚有6個獨特的殘基，至今未知這些序列是否與配體鞭毛蛋白識別的特異性相關。

若大西洋鮭LRR14能識別鞭毛蛋白，mTLR5和sTLR5將競爭性的結合配體，sTLR5可能被誘導為一種反饋調節機制來阻止對鞭毛蛋白的過量炎癥反應。在小鼠的巨噬細胞系中，選擇性的敲除可溶性mTLR4，有效阻止LPS介導的TNF-α的轉導以及NF-κB的激活。在調節sTLR5介導的鞭毛蛋白的炎癥反應中，正反饋和負反饋調節機制均存在。TLR5家族復雜的信號轉導途徑要等到配體結合位點確定后才能更加深入了解。

[1] Bell,J.K.,Mullen,G.E.,Leifer,C.A.,Mazzoni,A.,Davies,D.R.,Segal,D.M.,2003.Leucine-rich repeats and pathogen recognition in toll-like receptors.Trends Immunol.24(10),528-533.

[2] Takeda,K.,Kaisho,T.,Akira,S.,2003.Toll-like receptors.Annu.Rev.Immunol.21,335-376.456.

胡青(1991—)，女，漢族，湖北武漢人，研究生在讀，西華大學外國語學院，研究方向：英語筆譯。劉敏(1986—)，女，回族，江蘇南京人，研究生在讀，西華大學外國語學院，研究方向：英語筆譯。

S917.4

A

1672-5832(2016)04-0281-01