清潤養(yǎng)目口服液對干眼兔模型結(jié)膜炎性細胞表達的影響

鄭燕林 姚曼 彭曉麗 陳廷 鄭淼 王毅

·論著：實驗研究·

清潤養(yǎng)目口服液對干眼兔模型結(jié)膜炎性細胞表達的影響

鄭燕林1姚曼2彭曉麗3陳廷3鄭淼3王毅4

目的探討清潤養(yǎng)目口服液對兔暴露性干眼模型結(jié)膜炎性細胞表達的影響。方法將16只健康日本大耳白兔隨機分為4組：正常組、模型組、高劑量組、低劑量組，正常組不做任何處理，其余3組采用縫線法聯(lián)合第三眼瞼部分摘除方法造模；高、低劑量組每天分別予2.3 ml/kg、0.575 ml/kg的清潤養(yǎng)目口服液灌胃，模型組每天以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃28 d。各組分別于造模前，造模后即刻、2周、4周行角膜熒光素染色（CFS）、淚膜破裂時間（BUT）、淚液分泌量檢查（SIT）。造模后28 d處死動物，經(jīng)HE染色觀察清潤養(yǎng)目口服液對兔結(jié)膜炎性細胞表達的影響。結(jié)果（1）CFS、BUT、SIT：造模后2周，高、低劑量組及模型組的CFS評分、BUT、SIT較造模后即刻均有不同程度的改善（P＜0.05），高、低劑量組好于模型組（P＜0.05）。造模后4周，高、低劑量組上述三項指標較造模后2周進一步改善（P＜0.05），并好于模型組（P＜0.05），其中BUT、SIT結(jié)果與同期正常組接近（P＞0.05），高、低劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（2）病理組織學檢查：正常組，結(jié)膜組織內(nèi)未見明顯炎性細胞浸潤；模型組、高劑量組、低劑量組實驗兔結(jié)膜組織中均有不同程度的炎性細胞的表達，穹窿部炎性細胞的表達均強于球結(jié)膜部。高、低劑量組球結(jié)膜部炎性細胞表達明顯弱于模型組（P＜0.05）。結(jié)論清潤養(yǎng)目口服液可以減輕暴露性干眼模型兔的結(jié)膜炎癥反應，其對干眼的治療作用可能與此有關(guān)。

干眼；清潤養(yǎng)目口服液

干眼（dry eye）是指任何原因引起的淚液質(zhì)或量及動力學的異常，導致淚膜不穩(wěn)定和（或）眼表面的異常，并伴有眼部不適癥狀的一類疾病〔1〕。在干眼眾多的病因及臨床表現(xiàn)中，炎癥成為了不可忽視的致病因素。本研究所用清潤養(yǎng)目口服液主要在臨床上用于治療干眼，本實驗旨在觀察清潤養(yǎng)目口服液對兔暴露性干眼模型結(jié)膜炎性細胞表達的影響，從而探討該口服液治療干眼的機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取16只健康日本大耳白兔[動物合格證號：scxk（川）2013-14]，雌雄不限，體質(zhì)量在2.0～2.5 kg之間，經(jīng)裂隙燈檢查眼前節(jié)無異常者。隨機分為4組，正常組、模型組、高劑量組、低劑量組，每組4只（8只眼），正常組不做任何處理，模型組、高劑量組、低劑量組進行造模。

1.2 主要試劑藥品及實驗儀器

清潤養(yǎng)目口服液（主要藥物組成：北沙參、黃精、枸杞子、菊花等，由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供，批號：20121130）、75%乙醇、熒光素鈉溶液、淚液檢測濾紙條、鹽酸丙美卡因滴眼液、FAA固定液（成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院病理科提供）、電子秤、電子天平、眼科手術(shù)顯微鏡、眼科顯微手術(shù)器械、雙目生物顯微鏡（OLYMPUS）。

1.3 動物模型的制作

除正常組外其余3組實驗動物測量體質(zhì)量，麻醉，固定，眼瞼及其周圍以碘伏棉簽消毒3次、鋪巾，將上下眼瞼用4-0尼龍線褥式縫合固定于眶周皮膚上，摘除第3眼瞼，生理鹽水沖洗結(jié)膜囊。待成功蘇醒后放回籠中。暴露6 h后將兔從籠中取出，拆除縫線，完成造模。

1.4 干預方法

由成都中醫(yī)藥大學藥劑科提供清潤養(yǎng)目口服液成品，根據(jù)動物與人體的體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表，計算高劑量組每天予2.3 ml/kg的清潤養(yǎng)目口服液灌胃，低劑量組每天予0.575 ml/kg的清潤養(yǎng)目口服液灌胃，剩余以生理鹽水補足，模型組每天以等量生理鹽水灌胃，正常組不予任何處理。每天均于16:00—18:00灌胃1次，連續(xù)灌胃4周。每2周測量體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

1.5 檢測指標

1.5.1 干眼檢查：各組動物分別于造模前，造模后即刻、2周、4周行角膜熒光素染色（CFS）、淚液破裂時間（BUT）、Schirmer I試驗（SIT）檢查，每次檢查時間、地點、照明亮度、濕度及溫度相同，并均由同一個人完成。角膜熒光素染色：一人固定實驗兔，一人將熒光素鈉溶液滴入兔眼結(jié)膜囊內(nèi)，瞬目后，在裂隙燈鈷藍光下觀察，觀察角膜上皮完整性。評分方法：經(jīng)角膜中心做水平與垂直兩條線，將角膜劃分為4個區(qū)，每個區(qū)按0～3分評分，總共12分。0分：無染色；1分：染色在10個點以下；2分：染色在10個點以上30個點以下；3分，染色在30個點以上或呈片狀。淚膜破裂時間：結(jié)膜囊滴入熒光素溶液同前，一人固定實驗兔同時雙手撐開眼瞼，一人在裂隙燈鈷藍光下用寬裂隙光帶觀察，記錄從最后一次瞬目至角膜出現(xiàn)第一個黑斑即干燥斑的時間。SchirmerⅠ試驗：將淚液檢測濾紙條前端5 mm反折成直角，夾在實驗兔下瞼外側(cè)結(jié)膜囊內(nèi)，另一端懸掛在下瞼外部，檢測5 min后取出濾紙條，2 min后觀察并記錄濾紙條的濕長。

1.5.2 標本采集及病理分析：（1）取材及固定：造模給藥4周后，以空氣栓塞法處死實驗兔，在手術(shù)顯微鏡下分別取角鞏膜緣上方2 mm處、下方穹窿部大小約3 mm×3 mm結(jié)膜組織，并完整取下帶1 mm鞏膜環(huán)的角膜，放入FAA液中固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸臘、包埋，切片，烘干備用。（2）HE染色。（3）分析：①穹窿部結(jié)膜：結(jié)膜組織分上皮和固有層兩部分讀取數(shù)據(jù)，分別于200倍物鏡顯微鏡下觀察記錄炎性細胞數(shù)量，每組實驗兔結(jié)膜組織（穹窿部和球結(jié)膜部）均進行該項檢查，每個部位制作1張切片，每張結(jié)膜切片選取炎性細胞數(shù)量最多的3個視

野，用Mias-2000型圖形圖像分析儀測量炎性細胞面積、積分光密度、平均灰度，以積分光密度作為測量值，求取每張切片3個視野的總和作為該切片的測量值。②球結(jié)膜：因球結(jié)膜組織內(nèi)炎性細胞較穹窿部明顯減少，無法滿足3個視野要求，故改用分級的方法，即按照標準判定每只實驗兔球結(jié)膜的炎性細胞浸潤程度，并記錄。上皮及間質(zhì)炎癥程度按以下標準分級：（-）：無炎性細胞浸潤；（+）：灶性炎性細胞浸潤；（++）：多灶性炎性細胞浸潤；（+++）：片狀炎性細胞浸潤。詳見圖1。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；組內(nèi)的前后比較采用配對樣本t檢驗。對不符合正態(tài)分布的計量資料，多組間比較采用Kruskal-wailis H檢驗。等級資料多樣本比較采用Kruskal-wailis H檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物情況

實驗過程中有2只實驗兔因其他原因死亡，正常組、高劑量組各3只（6只眼）完成實驗，模型組、低劑量組各4只（8只眼）完成實驗。

2.2 CFS、BUT、SIT各時間段變化

造模前，四組實驗兔CFS、BUT、SIT比較均無明顯差異，且均在正常范圍內(nèi)，表明四組實驗兔具有組間可比性；造模后即刻，造模兔上述三種指標比較亦無明顯差異（P＞0.05），且均符合干眼診斷，表明模型成功，且干眼程度基本相同。造模后2周，高、低劑量組、模型組CFS、BUT、SIT較造模后即刻均有不同程度的改善（P＜0.05），高、低劑量組好于模型組（P＜0.05）。造模后4周，高、低劑量組上述三項指標較造模后2周進一步改善（P＜0.05），并好于模型組（P＜0.05），其中BUT、SIT結(jié)果與同期正常組接近（P＞0.05），高、低劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組造模后2周時的指標改善考慮為拆除眼瞼縫線后實驗兔自身恢復的結(jié)果，造模后4周三項指標未見明顯變化，提示干眼模型兔的眼表情況已趨于穩(wěn)定（表1～表3）。

2.3 病理組織學觀察

2.3.1 穹窿部：除正常組外，其余三組實驗兔穹窿部結(jié)膜炎癥程度相當（P＞0.05）（表4）。推測由于造模時穹窿部未長久暴露，對穹窿部炎性細胞的表達影響較小，故用藥組與模型組穹窿部炎癥情況無明顯差異。

圖1 實驗兔結(jié)膜組織學檢查分級（HE染色）A.（-）無明顯炎性細胞浸潤；B.（+）灶性炎性細胞浸潤（如黑箭所指，下同）；C.（++）多灶性炎性細胞浸潤；D.（+++）片狀炎性細胞浸潤

表1 各組實驗兔不同時間CFS評分比較（±s）

表1 各組實驗兔不同時間CFS評分比較（±s）

注：組內(nèi)比較（配對t檢驗），①與造模前比較P＜0.05，②與造模后即刻比較P＜0.05，③與造模后2周比較P＜0.05。組間比較（單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法），a與正常組比較P＜0.05，b與模型組比較P＜0.05CFS：角膜熒光素染色

組別眼數(shù)（只）造模前造模后即刻造模后2周造模后4周正常組60.00±0.000.00±0.000.67±0.530.67±0.53模型組80.00±0.008.23±0.96①a6.62±0.87①②a6.25±0.71①②a高劑量組60.00±0.008.13±1.06①a4.93±0.70①②ab1.29±0.49①②③ab低劑量組80.00±0.008.26±1.08①a5.33±0.65①②ab1.40±0.52①②③abF值0.000125.77186.025150.247 P值1.000＜0.001＜0.001＜0.001

2.3.2 球結(jié)膜部：正常組，球結(jié)膜復層柱狀上皮結(jié)構(gòu)清楚，細胞排列整齊有序，其間夾雜著數(shù)量較多的杯狀細胞，杯狀細胞內(nèi)可見黏液形成，上皮細胞未見變性、壞死、凋亡及炎性細胞浸潤，間質(zhì)中血管未見擴張、充血，結(jié)締組織中未見水腫、變性、壞死及炎性細胞浸潤；模型組，上皮細胞內(nèi)可見變性、壞死及炎性

細胞浸潤，炎性細胞浸潤以慢性炎性細胞為主，也可見少許急性炎性細胞，上皮細胞另可見凋亡，間質(zhì)內(nèi)血管擴張、充血及炎性細胞浸潤，炎性細胞浸潤以慢性炎性細胞為主，也有急性炎性細胞存在，未見明顯水腫。高、低劑量組鏡下表現(xiàn)基本相似，炎性細胞浸潤差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），上述改變較模型組有不同程度減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表5）。圖2所示為各組實驗兔球結(jié)膜部炎性細胞的表達情況。

表2 各組實驗兔不同時間BUT比較（±s，s）

表2 各組實驗兔不同時間BUT比較（±s，s）

注：組內(nèi)比較（配對t檢驗），①與造模前比較P＜0.05，②與造模后即刻比較P＜0.05，③與造模后2周比較P＜0.05。組間比較（單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法），a與正常組比較P＜0.05，b與模型組比較P＜0.05BUT：淚膜破裂時間

組別眼數(shù)（只）造模前造模后即刻造模后2周造模后4周正常組619.17±1.7218.00±1.6716.17±1.7217.83±1.33模型組819.00±2.677.07±1.45①a9.50±1.31①②a9.13±0.83①②a高劑量組619.33±2.507.23±1.28①a13.5±1.97①②ab17.50±2.25①②③b低劑量組819.13±2.237.42±1.40①a11.75±2.60①②ab15.88±2.23①②③bF值0.02386.40113.95739.588 P值0.995＜0.001＜0.001＜0.001

表3 各組實驗兔不同時間SIT比較±s，mm）

表3 各組實驗兔不同時間SIT比較±s，mm）

注：組內(nèi)比較（配對t檢驗），①與造模前比較P＜0.05，②與造模后即刻比較P＜0.05，③與造模后2周比較P＜0.05。組間比較（單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法），a與正常組比較P＜0.05，b與模型組比較P＜0.05SIT：Schirmer I試驗

組別眼數(shù)（只）造模前造模后即刻造模后2周造模后4周正常組6 1 9 . 3 3 ± 2 . 8 8 1 9 . 0 0 ± 2 . 1 0 2 1 . 3 5 ± 3 . 3 2b2 0 . 8 3 ± 3 . 4 5b模型組8 2 0 . 0 0 ± 3 . 0 2 5 . 5 9 ± 0 . 7 6①a1 2 . 4 6 ± 2 . 0 3①②a1 2 . 1 7 ± 1 . 4 3①②a高劑量組6 2 1 . 5 0 ± 5 . 3 1 5 . 7 6 ± 0 . 7 8①a1 6 . 7 3 ± 2 . 0 4①②ab1 8 . 5 5 ± 2 . 6 0①②③b低劑量組8 2 3 . 3 8 ± 5 . 1 8 5 . 7 1 ± 0 . 7 3①a1 5 . 3 3 ± 2 . 2 5①②ab2 0 . 0 7 ± 5 . 1 8①②③bF值1 . 3 0 8 2 0 3 . 6 2 5 1 5 . 8 9 1 9 . 5 4 8 P值0 . 2 9 5＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1

表4 各組實驗兔球穹窿部結(jié)膜內(nèi)炎性細胞浸潤情況比較±s）（以積分光密度總和表示）

表4 各組實驗兔球穹窿部結(jié)膜內(nèi)炎性細胞浸潤情況比較±s）（以積分光密度總和表示）

注：組間比較采用單因素方差分析

組別眼數(shù)（只）上皮間質(zhì)模型組819550.20±14876.2442653.87±28292.12高劑量組626456.88±17530.2937797.23±29226.70低劑量組820018.28±15670.7637698.93±23152.39 F值0.7460.213 P值0.5350.887

表5 各組實驗兔球結(jié)膜部結(jié)膜炎性細胞浸潤情況比較（單位：標本數(shù)，包括上皮標本、間質(zhì)標本）

圖2 各組實驗兔球結(jié)膜組織學檢查（HE染色）A.正常組結(jié)膜無明顯炎性細胞浸潤B.模型組可見大量炎性細胞浸潤C.高劑量組D.低劑量組亦可見炎性細胞浸潤，但程度較模型組明顯減輕

3 討論

清潤養(yǎng)目口服液所選處方于2007年9月始用于臨床。處方組成：制黃精、北沙參、枸杞子、菊花。功效：養(yǎng)陰潤目、清熱祛風。方中制黃精、枸杞子為君藥，具有補益肝腎、滋養(yǎng)腎陰之功效，臣以北沙參，養(yǎng)陰生津，更助君藥養(yǎng)陰之力，佐以菊花清熱祛風明目，載藥上承，使邪氣外達，亦可防止補益藥物過于滋膩。四藥相輔相成，藥少但功強，共奏養(yǎng)陰潤目，清熱祛風之功效，使肝腎之陰得以濡養(yǎng)，熱邪得清，津液運化輸布正常，目珠得養(yǎng)，故眼干澀、白睛紅赤、磣澀不適等癥得以緩解。前期的臨床觀察表明〔2〕：清潤養(yǎng)目方（免煎劑）聯(lián)合玻璃酸鈉滴眼液可以明顯改善干眼患者的自覺眼部癥狀及全身癥狀，在總體提高干眼生活質(zhì)量方面優(yōu)于單純予以玻璃酸鈉滴眼液治療的對照組。

2007年，國際干眼工作組將眼表炎癥反應列入了干眼發(fā)病因素之中〔3〕，隨之炎癥理論引起了臨床的廣泛重視，抗炎治療也發(fā)揮了一定的作用。目前大量的研究表明，很多中藥均具有良好的抗炎作用，且毒副作用小，資源豐富。清潤養(yǎng)目口服液是基于中醫(yī)理論，結(jié)合多年臨床實踐，通過不斷優(yōu)化，篩選出的組方。藥理學研究發(fā)現(xiàn)清潤養(yǎng)目口服液藥物組成中，黃精多糖是黃精的有效成分，孫化萍等〔4〕研究表明，含黃精多糖成分的滴眼液有抗炎、抗?jié)B出、抗增生的作用，治療干眼效果確切。薛春苗等〔5〕發(fā)現(xiàn)黃精多糖有明顯的滋陰作用。枸杞子〔6〕中的有效成分胡蘿卜素可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A，能促進視網(wǎng)膜內(nèi)視紫質(zhì)的合成或再生，維持正常視力。劉詠梅等〔7〕研究表明北沙參粗多糖（GLP）具有滋陰補虛作用，同時可增強體液免疫和細胞免疫功能。國外學者〔8〕經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)從菊花中分離得到的三萜烯二醇、三醇及其相應的棕櫚酸酯和肉豆蔻酸酯對由佛波酯（TPA）誘發(fā)的小鼠耳水腫具有明顯的抗炎作用。以上現(xiàn)代藥理學研究均已證實黃精、北沙參和菊花的抗炎作用。結(jié)合本實驗病理學觀察顯示，用藥28 d后，模型組實驗兔球結(jié)膜炎癥程度最重，高、低劑量組實驗兔球結(jié)膜炎癥程度較模型組明顯減輕，提示清潤養(yǎng)目口服液在減輕炎癥反應方面有一定療效。另外，本實驗結(jié)果中，用藥28 d后，高、低劑量組角膜熒光素染色明顯減少、淚膜破裂時間及淚液分泌量均明顯增加，即淚膜功能得到了一定程度的恢復，表明清潤養(yǎng)目口服液在重建眼表方面有一定療效。由此推測該口服液治療干眼的作用與減輕局部炎癥有關(guān)。

[1]李風鳴.中華眼科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：1153-1160.

[2]姚曼.清潤養(yǎng)目口服液治療肝腎陰虛型干眼的實驗研究及臨床觀察[D].成都中醫(yī)藥大學，2014.

[3]Lemp MA，Baudouin C，Baum J，et al.the definition and classification of Dry Eye Disease：Report of the Definition and classification subcommittee of the international Dry Eye Work shop（2007）[J]. Ocul surf，2007，5（5）：75-92.

[4]孫化萍，羅旭升，曾慶華，等.0.8%黃精多糖滴眼液對干眼癥的實驗研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2004，14（2）：67-69.

[5]任漢陽，薛春苗，張瑜，等.黃精粗多糖對溫熱藥致陰虛模型小鼠滋陰作用的實驗研究[J].山東中醫(yī)雜志，2005，24（1）：36-37.

[6]施仁潮.枸杞子[M].杭州：浙江科學技術(shù)出版社，2002：12-22.

[7]劉詠梅，劉波，王金鳳，等.北沙參粗多糖的提取及對陰虛小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國生化藥物雜志，2005，26（4）：224-225.

[8]MotohikoUkiya，Toshihiro Akihisa，Ken Yasukawa，et al.Constituents of compositae plants.2.Triterpene diols，triols，and their 3-o-fatty acid esters from edible chrysanthemum flower extract and their antiinflammatoryeffects[J].JAgricFoodChem，2001，49（7）：3187-3197.

The effect of Qingrun Yangmu oral liquid on the expression of conjunctiva inflammatory cells of dry eye rabbit model

ZHENG Yanlin，YAO Man，PENG Xiaoli，et al.The Ophthalmology of Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China

OBJECTIVE To discuss the effect of Qingrun Yangmu oral liquid on the expression of conjunctiva inflammatory cells of dry eye rabbit model.METHODS The 16 big-eared Japanese rabbit was randomly divided into 4 groups as normal group，model group，high dose group and low dose group.The normal group received non treatment but adaptive breeding，rabbits in the other three groups the model of dry eye by the method of suturing their eyelids to the skin and the partial removel of the third eyelid.CFS，BUT and SIT were examinated by the time point of befor modeling，immediately after modeling，2 weeks after modeling and 4 weeks after modeling.After given corresponding medicine for 28 days，killed the rabbits and taken out the eyes.The effect of Qingrun Yangmu oral liquid on the expression of conjunctiva inflammatory cells of dry eye rabbit model was observed by the HE stain.RESULTS（1）CFS，BUT，SIT：2 weeks after modeling compared with indexes of modeling accomplished，the CFS of model group，high dose group and low dose group were reduced，the BUT and SIT were prolonged.The differences of both the high dose group and low dose group were highly significant（P＜0.05）.Four weeks after-modeling，the three indicators of high dose group and low dose group were highly significant different compared with the instant figure after modeling and 2 weeks after-modeling（P＜0.05），but the model group had no significant change compared with 2 weeks after-model-

dry eye；Qingrun Yangmu oral liquid

R285.5

A

1002-4379（2016）01-0001-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.01.001

清潤養(yǎng)目口服液工藝質(zhì)量標準及藥理學研究（四川省中醫(yī)藥管理局，2012-G-031）

1成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院眼科，成都610075

2成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院眼科，成都610041

3成都中醫(yī)藥大學，成都610072

4成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院病理科，成都610075

姚曼，E-mail：manmanyao073@qq.com

ing（P＞0.05）.（2）The examination of the pathological histology：The control group，conjunctival tissue showed no significant inflammatory cell infiltration，but it had different levels of expression in the other three groups，the expression of inflammatory cell of fornix was stronger than the bulbar conjunctiva department.The expression of conjunctiva inflammatory cells in model group was stronger than that of the high dose group and the low dose group（P＜0.05）.CONCLUSIONS The Qingrun Yangmu oral liquid could reduce the inflammation reaction of dry eye rabbit model and it may be associated with the effect on the treatment.