單純性馬蹄內翻足模型鼠足踝部組織中Col9a1基因表達的研究

王正東，王鑫宇，顏南，孟欣雨，曾亮，王效杰

（1.沈陽醫學院基礎醫學院解剖學教研室，遼寧 沈陽 110034；2.基礎醫學院臨床醫學專業2014級3班；3.醫學應用技術學院康復教研室）

單純性馬蹄內翻足模型鼠足踝部組織中Col9a1基因表達的研究

王正東1，王鑫宇2，顏南3，孟欣雨2，曾亮1，王效杰1

（1.沈陽醫學院基礎醫學院解剖學教研室，遼寧 沈陽 110034；2.基礎醫學院臨床醫學專業2014級3班；3.醫學應用技術學院康復教研室）

目的：研究Col9a1基因在單純性馬蹄內翻足（idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV）模型鼠足踝部組織的表達規律。方法：制作ICTEV模型，分別取模型組及對照組大鼠足踝部組織，采用免疫熒光染色及免疫組化染色技術檢測Col9a1蛋白的表達。結果：模型組足踝部組織中Col9a1蛋白表達水平高于對照組（P＜0.05），主要分布在軟組織和軟骨膜。結論：Col9a1基因在ICTEV模型大鼠足踝部組織的表達升高可能與ICTEV畸形的產生有關。

全反式維甲酸；Col9a1基因；單純性馬蹄內翻足；組織；Ⅸ型膠原

單純性馬蹄內翻足 （idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV）是一類比較常見的先天性疾病，其主要表現為嬰兒出生即出現腓側肌肉痙攣，脛側肌肉因牽伸而松弛所導致的跟骨內翻、足尖內收、跖骨旋后、踝關節垂下，呈現馬蹄狀。先天和后天均能發病，發生率大約為1‰～6‰，男女比例約為3∶1［1］，且男性具有遺傳傾向［2］。其發病原因目前仍不明確。研究普遍認為主要的致病因素為基因遺傳、神經、肌肉病變、血管異常、軟組織痙攣等［3］，另外家族遺傳、吸煙、氣候等因素也是引起ICTEV的原因［4-5］。因此研究ICTEV的分子病理機制及其演變過程等顯得極為重要。

由于當前治療方法等因素限制，獲取ICTEV病理標本極為困難。因此，建立ICTEV模型是研究這種疾病致病因素和發病進程的重要基礎。有研究表明：全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）為維生素A衍生物在生物體內的正常存在形式，ATRA對多種動物有致畸作用。有報道稱，孕婦在妊娠初期為治療皮膚病服用維甲酸（RA）可導致胎兒畸形［6］。體內發育中的軟骨細胞為ATRA的主要靶細胞，高劑量的ARTA會影響生長過程中骨骼，有致畸作用。已有報道表明，ATRA可以誘導包括ICTEV在內的多種畸形發生［7］。本研究將使用ATRA誘導孕鼠制作ICTEV模型，作為研究ICTEV機制的模型。

在目前的研究中與下肢發育有關的基因有DTDST、COL9A1［8］、COL1A1［9］、FGF、GIL3［10-11］等。國內學者對84例ICTEV核心家族COL9A1基因簇的7個多態位點進行鑒別研究，結果顯示COL9A1基因可能為ICTEV的易感基因［8］。本研究通過ATRA灌胃孕鼠，制作ICTEV模型，觀察以這種方法制作的ICTEV模型與ICTEV患者之間是否具有一致性，并且通過進一步檢測ICTEV模型中Col9a1蛋白的表達水平及定位，來判斷其是否與人的Col9a1蛋白表達具有相關性。

1　材料與方法

1.1實驗動物普通級SD大鼠140只，雌雄各70只，體重320～350 g，購于沈陽醫學院實驗動物中心（動物合格證號2015-0001）。

1.2ICTEV模型的制作及取材將SD大鼠按雌雄比例1∶1置于籠中夜間交配，第2天通過陰道涂片檢查，獲得孕鼠63只。將孕10 d的大鼠隨機分為對照組（22只）和實驗組（41只），實驗組大鼠按135 mg/kg體重用灌胃法給予ATRA（Sigma公司），對照組給予相應體積礦物油。孕21 d剖腹取出胚胎，觀察并選取其足踝部前部內收、足后部內翻、跖骨旋后、向下垂呈現馬蹄狀的幼鼠，取幼鼠的軟組織制成標本。

1.3實驗方法

1.3.1免疫熒光方法檢測Col9a1蛋白的表達取實驗組和對照組幼鼠足踝部組織標本，甲醛固定1 d后，沉入40%蔗糖2 d，常規制作冰凍切片，采用免疫熒光方法檢測Col9a1蛋白表達部位。（1）取0.01 mol/L，pH 7.4的PBS滴于標本片上，保持10 min后棄除，置于有蓋瓷搪盒中，使標本片處于同一定濕度的環境；（2）使用0.01 mol/L，pH 7.4的PBS適當稀釋兔抗鼠Col9a1抗體（Santa Cruz Biotechnology公司），使標本片置于有蓋搪瓷盒內，37℃下保溫30 min；（3）將標本片從搪瓷盒中轉至標本架，首先使用0.01 mol/L，pH 7.4的PBS沖洗2次，然后依次使其經過0.01 mol/L，pH 7.4的PBS三缸浸泡，每缸5 min，不時振蕩；（4）取出標本片，用濾紙除掉部分水分，但不使標本片干燥，滴加一滴一定稀釋度的羊抗兔FITC標記的二抗（Santa Cruz Biotechnology公司）；（5）將標本片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30 min；（6）重復操作步驟（3）；（7）取出標本片，用濾紙除掉部分水分，滴加一滴緩沖甘油，覆上蓋玻片；（8）使用熒光顯微鏡進行觀察并拍照。

1.3.2免疫組化法檢測Col9a1蛋白的表達水平取實驗組和對照組幼鼠足踝部組織標本，甲醛固定1 d后，沉入40%蔗糖2 d，常規制作冰凍切片，免疫組化方法檢測Col9a1蛋白表達，用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶染色法，按試劑盒說明書操作。（1）PBS洗3次；（2）加入過氧化物酶阻斷液A滅活內源性酶，室溫下孵育10 min，PBS洗3次；（3）抗原修復，檸檬酸鹽緩沖液煮沸8 min，冷卻后取出；PBS洗3次；（4）加非免疫性動物血清封閉液B，甩去血清；（5）加入第一抗體4℃過夜，PBS洗3次；（6）加生物素標記的二抗，PBS洗3次；（7）加鏈親和素-過氧化物酶溶液D，PBS洗3次。（8）加DAB顯色，待顯色后自來水沖洗，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封固。（9）免疫組化染色分析：以不加一抗的正常切片為陰性對照。Col9a1蛋白為細胞質染色，與陰性對照進行比較。在100倍視野中隨機取4個視野，然后采用Imagepro plus 6.0軟件進行平均灰度值掃描。

1.4統計學方法采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1建模結果對照組孕21 d剖腹獲得幼鼠212只，實驗組孕21 d剖腹獲得幼鼠245只，其中74只幼鼠僅具有下肢足部畸形，占30.2%，與人類ICTEV患者足踝部具有一定相似性，均呈現足尖內收、踝骨內翻、距舟關節面由原來的向前轉向內側面，舟骨內側變小且向內移位，呈現內收畸形，足踝部整體呈現馬蹄狀，表明模型構建成功。2.2免疫熒光結果Col9a1蛋白主要定位于實驗組幼鼠足踝部軟組織及骨化中心部位，在骨細胞中只有少量表達，見圖1。

圖1　幼鼠足踝部組織Col9a1蛋白表達（免疫熒光染色，×100）

2.3免疫組化結果2組Col9a1蛋白均主要表達在足踝部軟組織中，在軟骨組織中主要表達在軟骨膜區域，在骨組織中有少量表達，陽性顆粒表達在細胞質，見圖2。實驗組幼鼠足踝部組織Col9a1蛋白表達的平均光密度比為（1.8±0.07），明顯高于對照組（1.0±0.05）（P＜0.05）。

3　討論

1980年，Ippolito等［12］提出了軟組織痙攣導致ICTEV的理論。2004年趙東風等［13-14］對15例ICTEV患者及5例非神經、膠原病及肌肉死亡的小兒的踝內側及腓骨肌深筋膜進行掃描電鏡對比研究后，推測ICTEV的致病因素可能為足內側肌肉纖維化，但是對具體的分子機制仍無法解釋。部分國外學者發現ICTEV患者的足跟部和足踝部韌帶出現異常增厚，認為可能是患兒足踝部出現了較多的肥大細胞和成纖維細胞［15］，這些細胞的增生增加了膠原纖維的厚度，可能是導致ICTEV的原因之一。膠原作為細胞外基質的主要成分，在維持組織器官的完整性，參與人體早期發育、器官形成、細胞趨化等方面均起到重要作用。當膠原的產生過多或過少時，都可能引起疾病。膠原根據分子結構分類，可以分為成纖維膠原和非成纖維膠原，其中Ⅸ型膠原可以與成纖維膠原相互作用。Col9a1基因在生長過程中編碼Ⅸ型膠原的α1鏈，是構成透明軟骨的重要膠原成分；而Ⅸ型膠原在調節Ⅱ型膠原直徑方面具有重要作用。Nakata等［16］研究發現在Col9a1開放閱讀框內有一段基因缺失可能導致輕微的軟骨發育不良，隨時間的推移會產生骨關節炎性病變。國內學者在25例ICTEV患兒的肌肉組織中檢測出22例COL9A1（88%）表達陽性，5例正常組織中2例COL9A1（20%）表達陽性，證明了COL9A1基因在人體內表達上調與ICTEV發生具有相關性［8，17］。

圖2　幼鼠足踝部組織Col9a1蛋白表達（免疫組化染色，×400）

在當前的醫療環境下，對于ICTEV的治療不再使用傳統皮下跟腱切除術而改用跟腱延伸術［18-19］，由于極難獲得患者的病例標本，因此建立穩定的動物模型極為重要。大量研究結果表明，當RA處于低濃度時，可以促進軟骨細胞生長，在高濃度則會抑制軟骨細胞生長而引起畸形。一些研究表明，RA的濃度稍稍有所改變將極大地影響成軟骨細胞的表達［20］。高濃度RA將過度激活RA受體，進而影響視黃酸信號系統引導的下游調控基因的表達，或干擾其他基因表達調控因子來調節靶基因，從而產生畸形［21］。本研究使用ATRA對實驗組孕鼠灌胃，孕21 d后剖腹取出胎鼠，將出現典型畸形足的實驗鼠與對照組相對比，發現實驗鼠足前部向內傾斜，距骨變小，位于跟骨后方，呈現菱形；脛骨關節內屈，跟骨發生內收，產生后足外旋、前足內旋［22-23］，內側肌腱、筋膜、韌帶等均存在不同程度的攣縮和變短，距骨骨化中心較正常小，其距骨頭和頸生長均發育異常，因此該模型與患兒ICTEV在形態上具有較高的一致性。但ATRA具有很強的胚胎毒性，造成許多例死胎、吸收胎，而且由ATRA產生的畸形不單單局限于足踝部，還表現在眼部畸形（表現為眼部突出、眼內流血、晶狀體渾濁），后足畸形（表現為馬蹄內翻足），尾部畸形（表現出無尾、短尾、螺旋尾），前肢短小，開放性脊柱裂等，甚至出現多種畸形共存，這些對ICTEV模型的制作產生了極大的影響。人類ICTEV患兒的致畸因素多種多樣，包含了遺傳、肌肉、神經、環境、氣候等，是由多種因素作用導致的，且僅僅表現在足踝部，全身其他部位并不表現出畸形，然而ATRA的致畸作用則是作用于全身，會有多種畸形合并的現象，目前普遍的ICTEV模型制作方法雖存在著與人ICTEV有一定的相似性，但也有很大的局限性。135 mg/kg ATRA灌胃制作ICTEV模型鼠是國內外學者普遍使用的模型制作方法，且135 mg/ kg ATRA制作的ICTEV模型具有的胚胎毒性和合并畸形率最少，是目前最接近人類ICTEV的模型。

在目前的模型基礎上，本研究采用免疫熒光標記檢測實驗組大鼠Col9a1蛋白的表達，發現Col9a1蛋白主要表達在足踝部軟組織中，尤其在骨化中心及軟骨骨膜中。并且2組大鼠經免疫組化染色后統計發現實驗組足踝部組織Col9a1蛋白表達水平明顯高于對照組。通過對比發現，通過ATRA灌胃制作的ICTEV模型與ICTEV患兒的COL9A1基因在軟組織表達上具有一定的相似性。但是由于沒有記載患兒足踝部軟骨及骨組織COL9A1基因表達的文獻，并且臨床上也無法獲得患兒患兒足踝部軟骨及骨組織病理標本，所以在該部位的表達無法比較。

有研究表明，前列腺素、糖皮質激素、血清、各種生長因子等，在膠原的生理生成和纖維化發展方面起著重要作用［24-25］。我們推測ATRA通過一系列途徑調節Col9a1基因表達上調，Col9a1基因編碼大量Ⅸ型膠原與成纖維膠原相互作用，產生了大量肥大細胞、成纖維細胞和纖維細胞［15］，隨后膠原發生聚集沉淀，導致ICTEV初期的局部纖維化，腓側肌肉痙攣產生較強的拉力，破壞正常的肌力平衡，將患足拉向內側畸形部位，即產生了距骨變下，位于跟骨后方，足前收，外踝后移與跟骨、肌腱等距離變短，距舟關節方向發生改變等表現。

綜上所述，目前由ATRA灌胃產生的ICTEV模型具有一定的局限性。理想的ICTEV模型應該是不具有胚胎毒性，并且全身其他部位不發生畸形。當前出現這種理想模型的概率僅有30.2%，建立優秀的動物模型是進行臨床疾病研究的首要工作，對研究ICTEV有重要的理論價值和臨床意義，因此在當前的模型基礎上進行突破創新，探索更加有效的制作方法是極為重要的。同時，RA調節Col9a1基因表達升高的調節途徑以及Col9a1基因以何種方式參與ICTEV的病程發展目前沒有明確的發現。因此，我們需要在動物模型的基礎上進一步尋找Col9a1基因的上游因子，以求揭示ICTEV產生的具體分子機制。

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（文敏編輯）

Expression ofCol9a1Gene in Ankle Tissue of Rat Model of Idiopathic Congenital Talipes Equinovarus

WANG Zhengdong1，WANG Xinyu2，YAN Nan3，MENG Xinyu2，ZENG Liang1，WANG Xiaojie1
（1.Department of Anatomy，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Grade 14 Class 3；3.Department of Rehabilitation）

Objective：To investigate the expression of Col9a1 gene in ankle tissue of rat model of idiopathic congenital talipes equinovarus（ICTEV）.Methods：ICTEV rat model was established.Immunofluorescence staining and immunohistochemical dyeing technology were used to detect the expression of Col9a1 protein in ankle tissue of model group and control group.Results：The expression level of Col9a1 protein in ankle tissue in model group was higher than that in the control group（P＜0.05），Col9a1 gene expressed primarily in soft tissue and cartilage membrane.Conclusion：The increasing expression level of Col9a1 gene in ankle tissue of ICTEV rats may be related to clubfoot deformity.

all-trans-retinoic acid；Col9a1；idiopathic congenital talipes equinovarus；tissue；collagen typeⅨ

沈陽醫學院博士科研啟動基金項目（No.20133055）

王正東（1977—），男（漢），副教授，博士，研究方向：單純性馬蹄內翻足分子遺傳學.E-mail：wzd_2008@163.com

R682.16

A

1008-2344（2016）06-0426-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.06.003

2016-06-16