響應面法優化章魚內臟酸性蛋白酶提取條件

黃惠莉, 張秀娟, 張育榮, 張鷺鷹, 王開明

(1. 華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021;2. 華僑大學 環境與資源技術研究所， 福建 廈門 361021；3. 廈門東海洋水產品進出口有限公司, 福建 廈門 361012)

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響應面法優化章魚內臟酸性蛋白酶提取條件

黃惠莉1,2, 張秀娟1, 張育榮3, 張鷺鷹3, 王開明3

(1. 華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021;2. 華僑大學 環境與資源技術研究所， 福建 廈門 361021；3. 廈門東海洋水產品進出口有限公司, 福建 廈門 361012)

首先，以章魚內臟為原料，通過單因素實驗，分析pH值、溫度、料液比、抽提時間對提取粗酶液中酸性蛋白酶活性的影響.然后，通過響應面法優化，得到多項式擬合回歸方程，并對酶活的預測值和實測值進行驗證.最后，測定粗酶液中蛋白酶的種類和活性.結果表明：酸性蛋白酶的最優抽提條件為pH值5.0、溫度30 ℃、時間2.5 h、料液比1∶5，由此得到的粗酶液酶活為917.2 nkat·g-1，對應比活為28.5 nkat·mg-1；響應面回歸方程計算的預測值與實際值位于誤差范圍內，說明該方程具有預測作用；粗酶液中，蛋白酶大部分為酸性蛋白酶，占總蛋白酶76.0%.

章魚內臟； 響應面優化； 酸性蛋白酶; 酶活； 比活

章魚(Octopusvulgaris)屬于軟體動物門、頭足綱、八腕目、蛸科、蛸屬，俗稱“八爪魚”，大部分為淺海性種類，也有少數深海性種類[1].在食品加工中，占章魚總質量50%的內臟表皮眼窩等部位被丟棄，既浪費又污染環境.近年來，對水產下腳料的再利用主要集中在酶解制備氨基酸及多肽[2-3]、膜法提取章魚胺等非蛋白質含氮類化合物[4]、酶制劑提取[5-6]等方面.在制備酶制劑方面，已成功從南極磷蝦中提取胰蛋白酶[7]、大鯢胃中提取胃蛋白酶[8]、淡水魚內臟中提取復合酶[9].在酶的提取方面，水、稀酸、稀鹽、稀堿、有機溶劑均可作為抽提液.考慮到酸性蛋白酶的溶解性和pH值的穩定性，本文以章魚內臟為原料，采用緩沖液進行抽提，以酸性蛋白酶活高低為指標，結合響應面法[10]，研究從章魚內臟中提取酸性蛋白酶的適宜條件，以獲取更多的酸性蛋白酶.

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

章魚內臟由廈門東海洋水產品進出口有限公司提供.由前期實驗測定可知，章魚盲腸無酸性蛋白酶活性.原料預處理方法：將章魚內臟摘除盲腸后，打碎勻漿，于-20 ℃保存備用.

實驗試劑：牛血清蛋白(北京奧博星生物技術有限責任公司)；干酪素(上海三浦化工有限公司)；檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉(廣東省西隴化工股份有限公司)；福林試劑(北京索萊寶科技有限公司).

儀器：ME204型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；TGL-20M型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；VIS-7220型可見光分光光度計(北京瑞科分析儀器公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；SXT-02型索氏提取器(上海洪紀儀器設備有限公司)；pH 700型臺式pH計(美國優特公司)；HJ-4A型數顯恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市醫療儀器廠).

1.2 實驗方法

1.2.1 章魚內臟組分測定 章魚內臟基本成分(水分、灰分、蛋白質和脂肪質量分數)的測定分別參照文獻[11-14].

1.2.2 粗酶液制備 稱取章魚內臟勻漿與檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液按照一定的比例混合，適宜溫度下抽提一定時間.于10 000 r·min-1轉速下，離心10 min，得到的上清液即為粗酶液.取上清液進行酸性蛋白酶的酶活測定，蛋白酶活性測定采用分光光度法[15].

1.2.3 單因素實驗 分別測定不同緩沖液pH值、溫度、料液比和抽提時間對粗酶液中酸性蛋白酶抽

提效果的影響.

1.2.4 響應面優化實驗 在單因素實驗基礎上，選取酶活為響應值(Y)，緩沖液pH值、溫度(θ)、抽提時間(t)、料液比為自變量，進行Box-Behnken響應面實驗[16].其實驗水平編碼值，如表1所示.表1中：+1，0，-1分別代表四因素的高、中、低水平.

1.2.5 粗酶液中蛋白酶種類及活性分析 為了驗證粗酶液中酸性蛋白酶的含量，分別測定粗酶液中酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活和比活.其中，酸性蛋白酶酶活測定采用pH值為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液體系；中性蛋白酶酶活測定采用pH值為7.0的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液體系；堿性蛋白酶酶活測定采用pH值為10.0的碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液體系.

2 結果與分析

2.1 章魚內臟基本成分

對章魚內臟組分進行分析，測得各組分的質量分數如下：水分為75.8%，灰分為2.6%，蛋白質為16.0%，脂肪為2.6%，其他為3.0%.由此可知，蛋白質質量分數僅次于水分,說明章魚內臟可作為提取蛋白酶等含氮類物質的原料.

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 pH值對粗酶液酶活影響 pH值是酶促反應的重要決定因素，酸性蛋白酶的最適pH值為2～6左右.在4 ℃，料液比為1∶5條件下,將一定量的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液加入章魚勻漿中，抽提4 h.控制pH值為2.2～7.0，測定40 ℃時，粗酶液的酸性蛋白酶酶活(z)，結果如圖1所示.由圖1可知：當pH值為2.2～5.0時，粗酶液中酸性蛋白酶活逐漸升高，這是因為隨著pH值的升高，酸性蛋白酶溶解度增大；當pH值為5.0～7.0時，酶活有所降低，這是由于pH值繼續增大至中性，使酸性蛋白酶的溶解度降低，酶活損失較大.因此，選擇浸提粗酶液的最佳pH值為5.0.

圖1 pH對粗酶液酸性蛋白酶酶活的影響 圖2 溫度對粗酶液酶活的影響Fig.1 Effect of pH on activity of acid Fig.2 Effect of temperature on activity of protease in crude enzyme solution acid protease in crude enzyme solution

2.2.2 溫度對粗酶液酶活影響 在pH值為5.0、料液比為1∶5、抽提時間為4 h的條件下，研究溫度(θ)對粗酶液中酸性蛋白酶酶活(z)的影響，結果如圖2所示.由圖2可知：當溫度為4～30 ℃時，酶活變化不大；當溫度繼續升高時，酶活急劇下降，這是因為高溫導致部分酶變性失活.由于低溫條件較難操控，且需額外消耗能源，因此，選取最佳溫度條件為30 ℃.

2.2.3 料液比對粗酶液酶活影響 在30 ℃，pH值為5.0，抽提時間為4 h的條件下，研究不同料液比對粗酶液酶活的影響，結果如圖3所示.由圖3可知：隨著緩沖液比例的增加，粗酶液酶活逐漸升高，當料液比為1∶5時，酸性蛋白酶活性達到最大；而后繼續增加緩沖液用量，酶活波動不大.這主要是因為相同質量的內臟中，酸性蛋白酶的含量是一定的，緩沖液越多，提取就越充分.然而，過多的緩沖液會增加后續濃縮過程的工作量.因此，選取最佳的料液比為1∶5.

2.2.4 抽提時間對粗酶液酶活影響 在30 ℃,pH值5.0,料液比為1∶5的條件下，研究不同抽提時間(t)對粗酶液酶活的影響，結果如圖4所示.由圖4可知：隨著抽提時間的增加，內臟勻漿與緩沖液接觸越充分，酸性蛋白酶酶活越高；當抽提時間為2.5 h時，酶活達到最高點，而后短時間內保持穩定；繼續增加抽提時間至4 h以上，酶活稍有下降，這是由于此時的粗酶液為液態，長時間放置會使酶活有少量的損失.因此，選取最佳提取時間為2.5 h.

圖3 料液比對粗酶液酶活的影響 圖4 時間對粗酶液酶活的影響 Fig.3 Effect of liquid ratio on activity of Fig.4 Effect of time on activity of acid acid protease in crude enzyme solution protease in crude enzyme solution

2.3 響應面結果分析

根據響應面設計29組實驗，經過實測后得到的結果，如表2所示.表2中：θ為溫度；t為抽提時間；z為粗酶液中酸性蛋白酶的酶活.

對表2的數據進行多項式擬合回歸，經優化后得到以酶活(Y)為因變量，以pH值(A)、溫度(B)、時間(C)、料液比(D)為自變量的回歸方程,即

(1)

對響應面回歸方程(1)進行系數顯著性檢驗和方差分析，結果如表3,4所示.由表3可知:模型大于F值的概率P<0.000 1，表明模型具有顯著的統計學意義，可信度較高；模型失擬項無統計學意義，表明若用此模型進行結果預測，出現失誤的概率不大；AB，BD，CD，A2，B2，D2的P值均小于0.05，表明其對粗酶液酶活的影響有統計學意義.根據模型線性數值的大小，可以得出影響粗酶液酶活的因素大小依次為pH值>抽提時間>溫度>料液比.

表2 響應面實驗結果

表3 響應回歸方程系數顯著性檢驗

表4 響應面回歸方程的方差分析

由表4可知：模型相關系數為0.913 2，說明該模型能夠解釋91.32%的總變異；模型確定系數越大，表示模型預測值與實際值之間的擬合越好，該模型的確定系數為0.826 3(大于0.80)，表明模型是顯著的；R2預測為0.529 9，表明模型是顯著的;變異系數越小，表示模型精度和可靠性越高，該模型變異系數為5.88%，說明模型是高度可靠的.

為了更直觀地檢測模型并確定最優點，兩兩因素之間互相作用的曲面圖，如圖5所示.

(a) 溫度與pH值 (b) 時間與pH值

(c) 料液比與pH值 (d) 時間與溫度

(e) 料液比與溫度 (f) 料液比與時間圖5 兩兩因素間的交互影響Fig.5 Interaction diagram between two factors

2.4 最優方案預測與驗證

由響應面結果可知，響應值Y存在最大值.Y值越大，說明所取的對應條件下，酸性蛋白酶酶活越高.響應面的理論最優方案如下：pH值為4.8，溫度為32.9 ℃，時間為2.8 h，料液比為1∶5.4.由此得到預測酸性蛋白酶酶活為915.2 nkat·g-1.為了驗證該模型的準確性，調整優化方案，取pH值5.0，溫度30 ℃，時間2.5 h，料液比1∶5為實驗條件，得到實測酸性蛋白酶酶活為917.2 nkat·g-1.預測值與實際值在誤差范圍內，說明該響應面回歸方程具有預測作用.

表5 粗酶液中蛋白酶種類分析

2.5 蛋白酶種類及活性的分析

采用優化條件(pH值5.0，溫度30 ℃，抽提時間2.5 h，料液比1∶5)，對章魚內臟勻漿進行提取，于10 000 r·min-1離心后得到粗酶液.對粗酶液進行酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活和比活測定，結果如表5所示.表5中：z為酶活;u為比活;η為比活百分比.由表5可知：酸性蛋白酶活性遠高于中性及堿性蛋白酶活性，說明經最優方案提取的粗酶液中大部分是酸性蛋白酶，該方案適合酸性蛋白酶的提取.

3 結論

以章魚內臟為原料，研究pH值、溫度、料液比、抽提時間等因素對提取酸性蛋白酶粗酶液酶活的影響.通過響應面法優化抽提條件，并經冷凍干燥得到酸性蛋白酶粗品.通過上述研究確定了各關鍵提取參數，為純化獲得章魚源性純品酸性蛋白酶提供了重要技術參數和應用參考.

成芳等[8]在大鯢胃中提取得到胃蛋白酶粗液的比活為17.2 nkat·mg-1；仇磊等[17]在扁玉螺食道腺內提取得到蛋白酶粗液的比活為24.3 nkat·mg-1；王琨[7]從南極磷蝦體內提取得到蛋白酶粗液的比活為0.7 nkat·mg-1.而文中提取的酸性酶酶活為917.2 nkat·g-1，對應比活為28.5 nkat·mg-1，說明采用響應面法優化提取得到的酸性蛋白酶含量較高.

對粗酶液中酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶活性進行分析，結果可知：酸性蛋白酶活性>中性蛋白酶活性>堿性蛋白酶活性.說明粗酶液中，酸性蛋白酶的含量遠高于其他種類蛋白酶含量.

文中提取的酸性蛋白酶為復合酶，需經鹽析、層析等操作后，才能對該復合酶的種類、相對分子質量等有進一步了解，從而純化得到純品酸性蛋白酶.

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(責任編輯： 黃曉楠 英文審校： 劉源崗)

Extraction Condition Optimization of Acid Protease From Octopus Viscera by Response Surface Method

HUANG Huili1,2, ZHANG Xiujuan1, ZHANG Yurong3,ZHANG Luying3, WANG Kaiming3

(1. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;2. Institute for Environment and Resources Technology, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;3. Xiamen East Ocean Aquatic Products Import and Export Company Limited, Xiamen 361012, China)

To investigate the pH value, temperature, solid-liquid ratio, and extraction time on the acidic protease activity of the crude enzyme solution, the single factor experiment was carried out using octopus viscera as the raw material. The regression was obtained equation by response surface methodology, and the accuracy between predicted and actual values was verified. Finally, the kind and activity of three proteases in the crude enzyme solution were measured. The results showed that the optimum extraction conditions of acid proteases were: pH 5.0, temperature 30 ℃, time 2.5 h, and solid-liquid ratio of 1∶5. Under these conditions, the enzyme activity was 917.2 nkat·g-1, and the specific activity was 28.5 nkat·mg-1. The predicted value and actual value lay within the range of error, which indicated that the regression equation has a predictive role. In addition, most of the total protease, approximately 76.0%, was acidic protease in the crude enzyme solution.

octopus viscera； response surface optimization； acid protease; enzyme activity; specific activity

10.11830/ISSN.1000-5013.201606011

2015-11-20

黃惠莉(1962-)，女，教授，主要從事海洋水產資源開發利用的研究.E-mail:hlhuang@hqu.edu.cn.

福建省重點科研資助項目(2013N0022)

Q 55

A

1000-5013(2016)06-0714-06