烏司他丁預先給藥對雙下肢缺血再灌注損傷后血漿細胞因子的影響

王乃田,于明軍,劉理金，屠偉峰

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烏司他丁預先給藥對雙下肢缺血再灌注損傷后血漿細胞因子的影響

王乃田1,于明軍2,劉理金3，屠偉峰4

目的 探討烏司他丁預先給藥對雙下肢缺血再灌注損傷后血漿細胞因子的影響。方法 30例擇期雙下肢需上止血帶(>150 min)手術的患者，隨機分為：對照組(NC組，n=10)、烏司他丁預先給藥組(UP1組，n=10)和烏司他丁治療組(UP2組，n=10)。UP1組于首次上止血帶前15 min靜脈滴注烏司他丁按6000 U/kg，末次松止血帶前15 min再次靜脈滴注6000 U/kg；UP2組末次松止血帶前15 min給予烏司他丁靜脈滴注12 000 U/kg；NC組：末次開放止血帶前15 min靜脈滴注等容積生理鹽水(均10 min內滴完)。3組患者首次上止血帶前20 min(缺血前)、末次松止血帶后30 min(再灌注后30 min)及術后(再灌注后)1 d、3 d和7 d ，取外周血檢測血漿C反應蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、和腫瘤壞死因子(TNF-α)水平。結果 與缺血前比較，再灌注后30 min、1 d及3 d，3組患者血漿CRP、IL-6、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，但UP1組、UP2組與NC組相比明顯低于后者[CRP：1 d(11.15±2.32)、(10.48±2.08) mg/l比NC(15.83±4.56)mg/l，3 d (4.29±1.89)、(3.89±1.34) mg/l比NC(6.78±2.95)mg/l；TNF-α：1 d(31.24±8.66)、(29.72 ±8.77) ng/l比NC(44.802 ±11.70)ng/l，3 d (13.75±5.11)、(15.73±4.16)ng/l比NC(20.787±8.05)ng/l；IL-6：1 d(160.80±46.95)、(179.72±35.77)ng/l比NC(329.50±95.34)ng/l，3 d (45.32 ±16.53)、(53.35±17.62)ng/l比NC(79.33±24.93)ng/l，P<0.05]，UP2組與UP1組間比較差異均無統計學意義；再灌注后7 d 3組患者血漿細胞因子均恢復正常。結論 烏司他丁預先給藥可有效地減輕雙下肢缺血再灌注所引起的全身炎性反應，使血漿CRP、IL-6、TNF-α上升幅度明顯受抑，從而可有效地阻抑炎性因子介導的組織器官損傷。

烏司他丁；雙下肢；缺血再灌注損傷；細胞因子

肢體缺血再灌注損傷是臨床常見的病理過程，各種原因造成的組織血液灌流量減少均可使細胞發生缺血性損傷，當恢復血液再灌注后，部分患者的細胞功能代謝障礙及結構被破壞反而更加嚴重，即再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)[1]，它往往會加重組織細胞功能代謝障礙及結構破壞。目前，缺血再灌注損傷所造成的遠離器官損傷，即非缺血區域組織器官損傷的現象日益引起人們的關注[2]。研究顯示，烏司他丁在體外循環、創傷打擊等條件下對于臟器保護有顯著的效果，烏司他丁可抑制炎性介質釋放，預防細胞因子級聯反應，抑制白細胞過度激活及炎性介質的釋放，阻斷細胞因子炎性介質與白細胞之間的惡性循環作用，減輕各種蛋白酶對機體組織器官功能的不良反應[3]。本研究擬觀察烏司他丁對止血帶引起的雙下肢缺血再灌注后血漿炎性細胞因子水平的影響。

1 對象與方法

1.1 對象 雙下肢需上止血帶的擇期手術患者30例，均為男性，年齡18～70歲[美國麻醉師學會(ASA)Ⅰ級]，隨機編入3組中：正常對照組(NC組，n=10)、烏司他丁預先給藥組(UP1組，n=10)和烏司他丁治療組(UP2組，n=10)。UP1組：于首次上止血帶前15 min靜脈滴注烏司他丁(商品名：天普洛安，廣東天普生化醫藥股份有限公司)6000 U/kg，溶于100 ml的生理鹽水中，10 min內靜脈滴注完，并于末次松止血帶前15 min，再取 6000 U/kg溶于100 ml的生理鹽水中，10 min內靜脈滴注完；UP2組：末次開放止血帶前15 min給予烏司他丁12 000 U/kg，溶于100 ml的生理鹽水中，10 min內靜脈滴注完；NC組：末次開放止血帶前15 min給予等容積生理鹽水靜脈滴注。所有患者術前均無高血壓、冠心病、免疫性疾病及肝腎功能不全史；1周內未使用激素和抗生素；超聲心動圖示無心律不齊、異位心率、ST段改變；所有生化檢查均未見異常；排除6個月內心肌梗死；近6個月來曾服用免疫抑制或免疫活性藥物，以及近期有發熱或明確感染者；并且排除止血帶時間短于150 min、不符合腰麻/硬膜外穿刺要求的患者，術后均使用靜脈自控鎮痛。

1.2 麻醉方法 術前常規禁食(8～12 h)，術前30 min肌肉注射苯巴比妥鈉0.1 g+東莨菪堿0.3 mg；患者選擇L2～3間隙行椎管內穿刺，從腰麻針內緩慢注入0.75%布比卡因2 ml+10%葡萄糖1 ml混合液(2±0.2) ml，麻醉平面上限控制在T10～11范圍，術中根據需要硬膜外適當追加藥物，靜脈未給任何鎮靜、鎮痛藥物。3組患者先自右下肢遠端用驅血帶驅血后，至大腿中上1/3上電腦止血帶(德國VBM 1000型)，壓力為80 kPa左右止血帶加壓止血。待右膝手術完成后，按同樣方法上左下肢止血帶。

1.3 標本采集 分別于首次上止血帶前20 min(缺血前)、末次松止血帶后30 min(再灌注后30 min)、術后(再灌注后)1 d、3 d和7 d于非輸液側肘靜脈抽血5 ml，3000 r/min離心15 min，分離血清，-70 ℃分裝保存待測血漿細胞因子。

1.4 檢測方法 IMMAGE免疫化學自動分析系統測定CRP(免疫化學發光法，BECKMAN COULTER公司產專用試劑盒)，ELISA法測定TNF-α、IL-6(北京福瑞生物工程公司提供試劑盒)。

2 結 果

2.1 一般資料 3組患者性別、年齡、體重、手術時間、止血帶壓迫時間以及失血量和輸血量均差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

2.2CRP的變化 在再灌注后30min、1d和3d，NC組血漿CRP水平明顯高于缺血前(P<0.05)，UP2組和UP1組也明顯升高，但與NC組相比明顯低于后者(P<0.05)，UP2組和UP1組間比較差異無統計學意義，再灌注后7d3組CPR均恢復正常(表2)。

組別年齡(歲)體重(kg)左側止血帶時間(min)右側止血帶時間(min)輸血量(ml)失血量(ml)手術時間(min)NC組51±1467±1186±785±81100±469850±141210±20UP1組47±1770±1689±589±61033±3881100±545197±32UP2組57±1164±891±987±81025±4331000±400214±14

表2 雙下肢缺血再灌注對血漿C-反應蛋白的影響 (n=10；mg/L；

注：與NC組比較,①P<0.05；與缺血前20min比較，②P<0.05

2.3TNF-α的變化 再灌注后30min、1d、3d，NC組血漿TNF-α水平均明顯高于缺血前(P<0.05)，UP1組、UP2組與NC組比較，明顯低于NC組(P<0.05)；UP2組和UP1組間比較差異無統計學意義(表3)。

2.4IL-6的變化 在再灌注后30min、1d、3d，NC組血漿IL-6水平明顯高于缺血前(P<0.05)，以再灌注后1d最高，UP1組、UP2組血漿IL-6水平也明顯升高，但與NC組比較，明顯降低(P<0.05)。UP1組與UP2組比較差異無統計學意義(表4)。

表3 烏司他丁對腫瘤壞死因子的影響 (n=10；ng/L；

注：與NC組比較,①P<0.05；與缺血前20min比較，②P<0.05

表4 烏司他丁對白介素-6的影響 (n=10；ng/L；

注：與NC組比較,①P<0.05；與缺血前20min比較，②P<0.05

3 討 論

組織器官缺血時，機體受損組織局部或全身可迅速發生炎性反應，CRP、IL-6和TNF-α是重要的炎性介質。CRP是第一個被認為是急性時相反應的蛋白，在急性反應及組織損傷時其血漿濃度急劇升高，是反映手術應激程度的重要指標，而且其濃度的高低與組織損傷程度具有明顯的相關性[4]。因此CRP已廣泛應用于各種炎性反應、損傷過程的判斷和監測。IL-6是具有多種生物活性的細胞因子，它能誘導急性期炎性反應的產生，促進多種免疫細胞的分化及活化，分泌免疫因子。有研究報道，接受擇期大手術的患者，切皮后30min，即可測到血漿IL-6水平升高，術后2～4h較術前相比差異非常顯著；接受擇期中等手術的患者，切皮后2～4h其血漿IL-6水平升高，并于術后4～6h達到峰值，持續時間約為48～72h。研究表明，IL-6在血漿中的濃度與手術所致的創傷大小有關[5]。TNF-α是一種自分泌的作用因子，在缺血再灌注損傷、膿毒癥、慢性心功能不全、病毒性心肌炎以及心臟移植排斥反應中均可導致心肌機能障礙和心肌細胞壞死[6]。TNF-α可直接損傷血管內皮細胞，免疫粘附、激活中性粒細胞產生多種活性物質導致組織器官損傷。在炎性介質的釋放過程中，TNF-α可能起著核心作用，其可誘導IL-6及其他繼發性炎性介質的釋放與激活，導致炎性反應逐步放大。

炎性反應在組織器官的損傷中起著重要作用。炎性細胞是早期組織細胞損傷的啟動步驟，炎性反應產物則促進了細胞損傷的進程。在炎性反應時，單核細胞及活化內皮細胞產生IL-6，刺激機體產生CRP，同時CRP具有與IgG和補體相似的調理及凝集作用，促使巨噬細胞的吞噬功能，刺激單核細胞表面的細胞因子表達及其他免疫調節，因此炎性介質的升高對于圍術期組織器官功能具有一定的負性作用。

烏司他丁是從人尿中提取的由143個氨基酸組成的廣譜蛋白水解酶抑制藥，抑酶活性強，對于多種水解酶有抑制作用。作為廣譜蛋白酶抑制藥，烏司他丁在臨床應用中，顯示了對急性胰腺炎、急性循環障礙等疾病的良好治療效果[7-9]。近年來臨床研究發現，其在抵御手術刺激，抑制圍手術期多種炎性介質的釋放，保護重要臟器功能等方面作用顯著[5,10]。有研究報道，將烏司他丁應用于心臟外科手術患者，能有效地抑制體外循環圍術期促炎細胞因子的釋放和氧自由基對機體的損傷，并有利于術后循環功能的恢復[11]。

本實驗中，3組患者在再灌注后30min，即可見血漿CRP、IL-6和TNF-α明顯升高，并于再灌注后1d達到峰值。UP1組、UP2組患者在使用了烏司他丁后，血漿細胞因子雖具有同樣的上升趨勢，但與NC組相比受到明顯抑制。再灌注后30min，UP1組、UP2組的細胞因子水平便顯著低于NC組，并且一直維持至再灌注后第3天。結果顯示，圍術期雙下肢缺血再灌注后血管內皮的炎性改變，這可導致包括CRP、IL-6和TNF-α在內的急性炎性蛋白反應性升高，而烏司他丁預先給藥對炎性因子的表達具有良好的調控作用，從而起到了抑制炎性過程的級聯反應和細胞因子的產生，減輕微血管壁的損傷，防止炎性反應對重要臟器損傷的作用。 雙下肢IRI患者圍術期促炎細胞因子IL-6、TNF-α和CRP的表達顯著增強，且各因子之間相互作用，炎性反應進一步放大，烏司他丁一方面對此類炎性因子具有抑制作用，另一方面可阻斷炎性因子的相互激活，從而可有效地保護肢體再灌注后對組織器官的損傷。本研究還發現烏司他丁對所測因子的作用以術后第1天最顯著，第7天與對照組無明顯差別。由于烏司他丁的半衰期較短，僅為40min左右，因此對術后炎性因子的作用，用藥時機、方式和劑量是否適宜肢體缺血再灌注的保護劑量，仍需繼續研究探討。

[1] 邵 壯，熊 江，郭 偉. 烏司他丁對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護作用及其機制[J].臨床和實驗醫學雜志,2014,13(10):777-781.

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(2015-11-06收稿 2016-06-20修回)

(責任編輯 岳建華)

Effects of ulinastatin on cytokines level in plasma following the both lower extremities ischemic reperfusion

WANG Naitian1,YU Mingjun2, LIU Lijin3, and TU Weifeng4.

1.Department of Anesthesiology, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039, China;2.The Medical Team of the Detachment Three of Hebei Province Corps,Chinese People’s Armed Police Force, Qinhuangdao 066100, China; 3.Graduate School,Jinzhou Medical University 121001, China；4.Department of Anesthestiolgy,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou, 510010, China

Objective To investigate the effects of ulinastatin (UTI) on plasma cytokines following intermittent continuous ischemic reperfusion(IR, cumulative time >150min ) of both lower extremities.Methods Thirty patients, both low extremities bound with tourniquets during operation, were randomly divided into three groups: normal control group(Group NC), UTI pretreatment group 1(Group UP1) and group 2(Group UP2). The patients in Group UP1 were intravenously infused with UTI 6000 U/kg 15 min before the tourniquet application and the last tourniquet loosening, respectively. The patients in Group UP2 were intravenously infused with UTI 12 000 U/kg 15 min only before the last tourniquet loosening, UTI was diluted with 100 ml sodium chloride and infused intravenously within 10 minutes. The patients in Group NC were administered with the same volume sodium chloride. At the time, 20 min before tourniquet apptionhor(before IR); 30 min after last tourniquet lossening(30 min after IR); and 1 d, 3 d, 7 d after IR, the peripheral blood was sampled to measure plasma levels of C reactive protein(CRP), interleukin-6(IL-6), and tumor necrosis factor-α(TNF-α).Results The levels of CRP, IL-6 and TNF-α in the three groups all rose significantly 30 min, 1 d and 3 d after IR compared with those before IR respectively(P<0.05). But the levels of the cytokines in Group UP1 and UP2 were significant lower than those in Group NC[CRP：1 d(11.15±2.32)、(10.48±2.08)mg/lvsNC(15.83±4.56)mg/l，3 d (4.29±1.89)、(3.89±1.34)mg/lvsNC(6.78±2.95)mg/l；TNF-α：1d(31.24±8.66)、(29.72 ±8.77)ng/lvsNC(44.802 ±11.70)ng/l，3 d (13.75±5.11)、(15.73±4.16)ng/lvsNC(20.787±8.05)ng/l；IL-6：1 d(160.80±46.95)、(179.72±35.77)ng/lvsNC(329.50±95.34)ng/l，3 d (45.32 ±16.53)、(53.35±17.62)ng/lvsNC(79.33±24.93)ng/l，P<0.05]. There were no significant differences between Group UP1 and Group NC in each time in terms of the cytokines(P>0.05). The inflammatory cytokines recovered to the same level 7 d after IR.Conclusions UTI pretreatement may relieve the system inflammatory reaction following both low extremities, prevent the increases of plasma cytokines after IR, thus may attenuate organ damage mediated by cytokines.

ulinastatin；both low extremities；ischemic reperfusion injury；cytokines

廣州科技計劃項目(200821-E421)

王乃田，博士，主治醫師。

1.100039 北京，武警總醫院麻醉科，2.066100 秦皇島，武警河北總隊第三支隊衛生隊，3.121001，錦州醫科大學研究生院，4.510010，廣州軍區廣州總醫院麻醉科

屠偉峰，E-mail：wftuyx02@163.com

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