甲狀旁腺激素(1-34)、多聚賴氨酸應用于口腔種植體表面促成骨作用研究

王星星，羅小龍，吳 剛，韓 旭，郭曉晶，汪大林

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甲狀旁腺激素(1-34)、多聚賴氨酸應用于口腔種植體表面促成骨作用研究

王星星1，羅小龍1，吳 剛1，韓 旭1，郭曉晶2，汪大林1

目的 研究甲狀旁腺激素(parathyroidhormone,PTH)(1-34)、多聚賴氨酸應用于種植體表面的促成骨作用。方法 將PTH(1-34)和多聚賴氨酸通過層層自組裝的方式涂層到種植體表面。按照涂層制備方法和PTH(1-34)濃度將種植體分為4個組：PLL載體組(A組)、10μg組(B組)、100μg組(C組)和空白對照組(D組)。使用ELISA法探索該涂層的體外藥物釋放規律；將小鼠胚胎成骨前體細胞MC3T3-E1接種于涂層后的種植體表面，使用MTT法、堿性磷酸酶半定量、PCR等方法，檢測該涂層在體外條件下對成骨細胞生物學行為的影響。結果 通過層層自組裝技術于鈦種植體表面制成的PLL-PTH(1-34)聚電解質多層膜涂層在初始階段表現出明顯的釋放過程，隨后釋放程度趨于平緩，第14天時仍可檢出PTH(1-34)。MTT檢測：第5 天時C組OD值(1.738±0.026)與第1天(1.663±0.045)相比有明顯升高(P=0.0219)。堿性磷酸酶半定量：第14天時，C組(3.377±0.336)U/gprot明顯高于A組(2.537±0.083)U/gprot、B組(2.843±0.060)U/gprot和D組(2.063±0.061)U/gprot，差異均有統計學意義(P<0.05)。PCR檢測：ALP基因于第7天時各組表達水平最高，且C組明顯高于A、B、D三組，差異均有統計學意義(P<0.05)；OCN基因于第14天時各組表達水平最高，且C組明顯高于A、B、D三組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 在鈦種植體表面可以通過層層自組裝技術制成PLL-PTH(1-34)聚電解質多層膜涂層。通過該技術可以實現PTH(1-34)較長時間的局部釋放，從而促進其表面成骨細胞的增殖和分化。

PTH(1-34)；多聚賴氨酸；層層自組裝技術；種植體

為了使口腔種植體獲得理想的種植體-骨界面，即骨結合，從初次植入到二次手術通常需要間隔3～6個月[1]。因此，提高種植體的成功率和早期穩定性一直是研究的熱點。應用生物活性因子改善骨結合是常見的方法之一。甲狀旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)是由甲狀旁腺細胞產生和分泌的一種直鏈多肽，具有調節機體鈣、磷代謝的重要作用，在骨代謝中具有促進骨形成與骨吸收的雙重效應：間歇應用可促進骨形成，而持續應用會誘發骨吸收。因此，筆者從提高種植體骨結合水平、縮短種植體骨結合形成時間的角度出發，設計應用具有促進骨形成作用的PTH(1-34)對種植體表面進行處理，以期在保留其生物學活性的同時，還能具有控釋的效果，從而達到促進成骨的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 純鈦鈦片(Ti，99.997%，直徑10 mm，厚1 mm，西安寶雞鈦業有限公司)，多聚賴氨酸(polylysine, PLL)(Sigma公司)，PTH(1-34)(Bachem公司)，小鼠胚胎成骨前體細胞MC3T3-E1(中國科學院細胞庫)，α-MEM培養液、胎牛血清、胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉(Gibco公司)，地塞米松(上海榕柏公司)，MTT檢測試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成有限公司)，Trizol抽提試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒(TakaRa公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 鈦種植體表面涂層的制備 將純鈦鈦片加工成1 mm厚，直徑為15 mm的圓形鈦片，共114片。依次用200#、400#、600#、800#、1200#、1500#、2000#的砂紙打磨拋光。再用丙酮和無水乙醇洗滌，最后用蒸餾水超聲清洗30 min，室溫下干燥。將干燥的鈦片置于5 mol/L的NaOH溶液室溫浸泡30 min，然后再用蒸餾水超聲清洗15 min，室溫下干燥。鈦片按實驗要求分為4組，A組(PLL載體組)27片先浸入1 mg/ml的PLL溶液20 min，取出后用0.1 mol/L的PBS溶液沖洗3次。室溫下干燥，備用。B組(10 μg組)和C組(100 μg組)各30片，首先浸入1 mg/ml的PLL溶液20 min，取出后用0.1 mol/L的 PBS溶液沖洗3次。然后B組浸入用PBS溶液配制成的濃度為10 μg/ml的PTH(1-34)溶液20 min，C組浸入用相同方法配制成的濃度為100 μg/ml的PTH(1-34)溶液20 min，取出后用0.1 mol/L PBS沖洗3次。上述步驟重復進行9次，最后再次浸入1 mg/ml的PLL溶液20 min，取出后用0.1 mol/L的 PBS溶液沖洗3次，室溫下干燥，備用。D組(空白對照組)27片用作對照不再進行任何處理。

1.2.2 體外藥物釋放 取B組和C組各3枚試片放入細胞培養板中。每組3個副孔，每孔注入1 ml PBS，將24孔板置于恒溫搖床內。并于第6、8、12 小時和第1、2、3、5、7、10、14天時將各副孔中的緩釋液全部吸出，-80 ℃保存，并向每孔中加入新的1 ml無菌PBS。完成最后一次樣品采集后將所有樣品和留存PTH(1-34)溶液解凍，用ELISA法分析樣本中PTH(1-34)的濃度，進行數據分析。

1.2.3 細胞培養 取小鼠胚胎成骨前體細胞MC3T3-E1(中國科學院細胞庫)，于37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下的恒溫培養箱中培養，隔天換液，培養液為含有10%胎牛血清的α-MEM，鏡下觀察細胞達90%左右進行傳代培養。

1.2.4 細胞增殖檢測 按1.2.1的方法獲得4組鈦片，每組9塊，分為3個小組分別置于3個24孔培養板中。將MC3T3-E1細胞以4×104個/孔接種到上述鈦片上，分別于第1、3、5 天取出一塊培養板，使用MTT法在相同的條件下培養，吸取上清用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長下測量吸光度值。

1.2.5 堿性磷酸酶半定量 按1.2.1的方法獲得4組鈦片，每組9塊，分為3個小組分別置于3個24孔培養板中。另外，取MC3T3-E1細胞按2×104個/ml接種到培養板中，于恒溫培養箱中培養24 h，將普通培養液換成誘導培養液(原培養液、0.01 mol/Lβ-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、10-8 mol/L地塞米松)，3 d換液。于培養第4、7、14 天取出一塊培養板，檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性。檢測時按試劑說明加入細胞裂解液200 μl，37 ℃條件下裂解4 h，振蕩0.5 h。取150 μl裂解液，加入等量底物反應液，在37 ℃條件下水浴30 min，用酶聯免疫檢測儀在405 nm處測定吸光度值(D405)。再取10 μl裂解液，加入200 μl蛋白分析液，室溫下震蕩5 min，酶聯免疫檢測儀在630 nm處測定吸光度值(D630)，于標準曲線上求得總蛋白濃度。按照ALP=D405/總蛋白濃度求得ALP值。

1.2.6 成骨基因表達 按1.2.5的方法進行細胞培養和誘導分化，于培養的第4、7、14 天取出一塊培養板。Trizol抽提細胞總 RNA，反轉錄試劑盒合成 cDNA模板。擴增成骨相關基因，用定量PCR儀獲得擴增和溶解曲線以及循環閾值(cycle threshold, Ct)。用ΔCt= Ct標本-Ctβ-action對標本基因的表達強度進行校正。以相對表達量(2-ΔΔCt)為檢測值。

PCR所用引物序列為：

ALP：上游，5′-GCAGGATTGACCACGGACACTA-TG-3′；下游，5′-TTCTGCTCATGGACGCCGTGAAGC-3′。

OCN：上游，5′-AGGAGGGCAATAAGGTAGTGAA-3′；下游，5′-TACCATAGATGCGTTTGTAGGC-3′。

β-action: 上游，5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3′；下游，5′-TGGACTTCGAGCAAGAGAGATGG-3′。

1.3 統計學處理 采用SAS 9.3和SPSS 18.0進行數據分析。計量數據采用的形式表示；采用重復測量的方差分析法分析不同處理的作用及處理與時間的交互作用等，相同處理組兩時間點的差異采用配對樣本t檢驗進行分析；相同時間點不同處理組的比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PTH(1-34)的體外釋放 如圖1所示，B組和C組釋放趨勢相似：均在初期(第6小時至第3天)表現出明顯的釋放過程，第3天后釋放量開始減少，且到第14天時仍能檢出。

圖1 PTH(1-34)體外釋放ELISA檢測B：10 μg組；C： 100 μg組

2.2 細胞增殖 處理與時間無交互作用(P=0.1016)，處理組的差異有統計學意義(F=57.99，P<0.0001)。A組OD值第5 天與第3天相比有明顯降低，差異有統計學意義(P=0.0132)；C組第5 天OD值與第1天相比有明顯升高，且差異有統計學意義(P=0.0219，表1)。

2.3 堿性磷酸酶半定量 如圖2所示，隨著處理時間的延長不同材料表面的堿性磷酸酶活性均表現出上升的趨勢。第4天時，B組與C組間差異無統計學意義，C組低于A組和D組，且差異均有統計學意義(P<0.05)；第7天時，B組與C組間差異仍

無統計學意義，但C組略高于A組和D組，差異均有統計學意義(P<0.05)；第14天時，C組(3.377±0.336)U/gprot明顯高于A組(2.537±0.083)U/gprot、B組(2.843±0.060)U/gprot和D組(2.063±0.061)U/gprot，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 成骨細胞在4組材料表面3個時間點的OD值 (n=3；

注：A.PLL載體組，B.10 μg組，C.100 μg組，D.空白對照組；與第3天比較，①P<0.05；與第1天比較，②P<0.05

圖2 成骨細胞在不同時間點4種不同材料表面ALP的活性

2.4 成骨基因表達 如圖3A所示，ALP基因的表達水平在第4天時C組與A、B、D三組間差異均有統計學意義(P<0.05)，且C組低于A組和D組。第7天時各組表達水平最高，且第7天和第14天時C組均明顯高于A、B、D三組，差異均有統計學意義(P<0.05)。OCN基因的表達水平在第4天時C組低于A組和D組。各組表達水平在第14天時最高，且第7天和第14天時C組均明顯高于A、B、D三組，差異均有統計學意義(P<0.05，圖3B)。

圖3 3個時間點不同材料表面成骨細胞ALP、OCN基因表達水平

3 討 論

層層自組裝是一種簡單而有效的種植體表面改性的方法，通過層層自組裝技術可以將帶相反電荷的聚電解質在種植體表面交替沉積成聚電解質多層膜，并可以通過調節聚電解質的種類、多層膜的厚度以及多層膜中所附載的具有生物學活性的物質，賦予種植體材料多種不同的功能。而且這種方法操作簡單，制備條件溫和，容易實施。根據對已有的文獻檢索尚未有將層-層自組裝技術用于甲狀旁腺激素對種植體表面改性應用的研究報道。

筆者利用氫氧化鈉對鈦種植體表面進行處理，使其表面攜帶負電荷。使該材料在中性的PLL溶液中可以吸附一層帶正電荷的PLL。PLL是一種親水性的生物可降解大分子，對生物體無不良反應，具有良好的生物相容性，在體內可以降解為小分子的氨基酸，被生物體吸收。另外，PTH(1-34)在中性溶液中帶負電荷，因此，可以實現與PLL在鈦種植體材料表面的交替沉積。本研究表明在鈦種植體表面通過層層自組裝技術制成的PLL-PTH(1-34)聚電解質多層膜涂層在PBS溶液中初始階段表現出明顯的釋放過程，隨后釋放程度趨于平緩，第14天時仍能檢出。

PTH是由甲狀旁腺細胞產生和分泌的，一種具有調節機體鈣、磷代謝重要作用的激素。2002年人工合成的PTH(1-34)被FDA批準應用于骨質疏松癥的臨床治療[2-6]。有研究發現，PTH可以在骨質疏松的情況下促進種植體骨結合[7-11]。但PTH具有促進骨形成和骨吸收的雙重效應[12-17]。有研究認為，PTH對骨代謝的調節作用主要取決于血清中PTH濃度高于內源性PTH基線水平的時間[18]。PTH首先在沒有引起骨吸收的情況下促進骨形成[19]。隨后骨重建活動增加，并逐漸達到峰值，但總體表現仍是促進骨形成[20]，然后PTH引起的骨量增加的效應開始衰減[21]。因此在美國PTH(1-34)的推薦總療程不超過18個月[22]。

在口腔種植領域有學者嘗試了PTH的局部應用，以期能夠達到促進種植體骨結合的目的，同時避免全身應用的弊端。Valderrama等[23]的研究發現含有PTH的水凝膠可以明顯地促進種植體周圍骨愈合。Yu等[24]將PTH摻入到鈦種植體表面磷酸鈣涂層中，經體內研究發現PTH的引入可以促進種植體骨結合。因此，我們設想用適當的方式實現PTH的局部釋放，從而在避免全身性應用的同時實現促進種植體骨結合的目的。

本研究將MC3T3-E1細胞接種于四種種植體材料(A：PLL載體組、B：10 μg組、C：100 μg組、D：空白對照組)表面。經MTT檢測發現，前3 d各組鈦種植體表面的成骨細胞均表現出明顯的增殖，說明該涂層沒有影響成骨細胞在鈦種植體材料表面的早期增殖。第5天時，當A組和D組成骨細胞增殖出現減少時B組表現不明顯，而C組則保持不變，說明引入PTH(1-34)的涂層可以發揮其促進成骨細胞增殖的能力。通過成骨細胞堿性磷酸酶半定量分析可以發現，在C組材料表面，堿性磷酸酶活性從第7天開始高于A組和D組，但與B組相比差異無統計學意義。第14天時C組則明顯高于A、B、D三組，差異有統計學意義。從成骨細胞相關基因的表達分析也可以看出引入PTH(1-34)后的B組和C組材料有助于促進成骨相關基因ALP和OCN的表達。尤其是C組第7天時ALP基因表達水平最高，且明顯高于其他三組，差異有統計學意義。第14天時C組OCN基因表達水平最高，且明顯高于其他三組，差異有統計學意義。因此，可以說明引入PTH(1-34)的涂層可以發揮其促進成骨細胞分化的能力。

綜上所述，在鈦種植體材料表面可以通過層層自組裝技術制成PLL-PTH(1-34)聚電解質多層膜涂層。通過該技術可以實現PTH(1-34)較長時間的局部釋放，從而促進其表面成骨細胞的增殖和分化。

[1] Branemark P I. Osseointegration and its experimental background [J]. J Prosthet Dent,1983,50(3):399-410.

[2] Qin L, Raggatt L J, Partridge N C. Parathyroid hormone: a double-edged sword for bone metabolism [J]. Trends Endocrinol Metab, 2004,15(2):60-65.

[3] Farra R, Sheppard N F, Mccabe L,etal. First-in-human testing of a wirelessly controlled drug delivery microchip [J]. Sci Transl Med,2012,4(122):122ra121.

[4] Nardi A, Ventura L, Cozzi L,etal. The bone anabolic therapy [J]. Aging Clin Exp Res, 2013, 25 (Suppl 1):S121-S124.

[5] Hadji P, Zanchetta J R, Russo L,etal. The effect of teriparatide compared with risedronate on reduction of back pain in postmenopausal women with osteoporotic vertebral fractures [J]. Osteoporos Int, 2012,23(8):2141-2150.

[6] Mcneilly T, Mcnally C, Finch M,etal. Recombinant PTH: a study of the outcome of teriparatide therapy for 138 patients with osteoporosis [J]. Ulster Med J, 2013,82(2):89-93.

[7] Gabet Y, Muller R, Levy J,etal. Parathyroid hormone 1-34 enhances titanium implant anchorage in low-density trabecular bone: a correlative micro-computed tomographic and biomechanical analysis [J]. Bone, 2006, 39(2): 276-282.

[8] Shirota T, Tashiro M, Ohno K,etal. Effect of intermittent parathyroid hormone (1-34) treatment on the bone response after placement of titanium implants into the tibia of ovariectomized rats [J]. J Oral Maxillofac Surg, 2003, 61(4): 471-480.

[9] Almagro M I, Roman-Blas J A, Bellido M,etal. Pth[1-34] enhances bone response around titanium implants in a rabbit model of osteoporosis [J]. Clin Oral Implants Res, 2013, 24(9): 1027-1034.

[10] Ohkawa Y, Tokunaga K, Endo N. Intermittent administration of human parathyroid hormone (1-34) increases new bone formation on the interface of hydroxyapatitecoated titanium rods implanted into ovariectomized rat femora [J]. J Orthop Sci, 2008,13(6):533-542.

[11] Li Y F, Li X D, Bao C Y,etal. Promotion of peri-implant bone healing by systemically administered parathyroid hormone (1-34) and zoledronic acid adsorbed onto the implant surface [J]. Osteoporos Int, 2013, 24(3): 1063-1071.[12] Onyia J E, Helvering L M, Gelbert L,etal. Molecular profile of catabolic versus anabolic treatment regimens of parathyroid hormone (pth) in rat bone: an analysis by DNA microarray [J]. J Cell Biochem, 2005, 95(2): 403-418.[13] Li X, Liu H, Qin L,etal. Determination of dual effects of parathyroid hormone on skeletal gene expression in vivo by microarray and network analysis [J]. J Biol Chem, 2007, 282(45): 33086-33097.

[14] Jilka R L, O'brien C A, Ali A A,etal. Intermittent pth stimulates periosteal bone formation by actions on post-mitotic preosteoblasts [J]. Bone, 2009, 44(2): 275-286.[15] Augustine M, Horwitz M J. Parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein analogs as therapies for osteoporosis [J]. Curr Osteoporos Rep, 2013, 11(4): 400-406.

[16] Tam C S, Heersche J N, Murray T M,etal. Parathyroid hormone stimulates the bone apposition rateindependently of its resorptive action: Differential effects of intermittent and continuous administration [J]. Endocrinology,1982,110(2):506-512.

[17] Datta N S, Abou-Samra A B. Pth and pthrp signaling in osteoblasts [J]. Cell Signal,2009,21(8):1245-1254.

[18] Ishizuya T. Effects of parathyroid hormone on bone metabolism : differences between intermittent and continuous treatment [J]. Clin Calcium, 2012, 22(3): 357-363. [19] Jilka R L. Molecular and cellular mechanisms of the anabolic effect of intermittent PTH [J]. Bone, 2007, 40(6): 1434-1446.

[20] Cosman F, Nieves J, Zion M,etal. Daily and cyclic parathyroid hormone in women receiving alendronate [J]. N Engl J Med, 2005, 353(6): 566-575.

[21] Hodsman A B, Bauer D C, Dempster D W,etal. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: A review of the evidence and suggested guidelines for its use [J]. Endocr Rev, 2005, 26(5):688-703.[22] 劉 明,潘 薇,陳德才.甲狀旁腺激素治療骨質疏松癥的研究進展 [J]. 中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志, 2012,5(2):151-156.

[23]ValderramaP,JungRE,ThomaDS, et al.Evaluationofparathyroidhormoneboundtoasyntheticmatrixforguidedboneregenerationarounddentalimplants:ahistomorphometricstudyindogs[J].JPeriodontol, 2010, 81(5): 737-747.

[24]YuX,WangL,JiangX, et al.Biomimeticcapcoatingincorporatedwithparathyroidhormoneimprovestheosseointegrationoftitaniumimplant[J].JMaterSciMaterMed, 2012, 23(9): 2177-2186.

(2016-03-20收稿 2016-06-15修回)

(責任編輯 武建虎)

A study on osteogenesis promoted by PTH (1-34) and polylysine coating on the surface of implant

WANG Xingxing1, LUO Xiaolong1, WU Gang1, HAN Xu1, GUO Xiaojing2, and WANG Dalin1.

1.Department of Stomatology, Changhai Hospital，2. Department of Modical Statistics, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

Objective To promote osteogenesis, parathyroid hormone which can promote bone formation was used to process surface of implant material.Methods Parathyroid hormone PTH (1-34) and polylysine were coated to the surface of the implant material through layer by layer self-assemble technique. ELISA was used to explore theinvitropharmacokinetics regularity of the coating. The mouse embryos osteogenesis precursor cells MC3T3 E1 were seeded on the coated implant material surface. MTT, alkaline phosphatase semi-quantitative and PCR methods were used to detect theinvitroinfluence of osteoblast biology behavior.Results PLL - PTH (1-34) polyelectrolyte multilayer membrane coating made by layer by layer self-assemble technique showed significant release process in the initial phase, then the release leveled off, and PTH (1-34) could be detected until 14 d. MTT: OD value of group C (1.738±0.026) on the 5 d elevated compared with 1 d (1.663±0.045) (P=0.0219). Alkaline phosphatase semi-quantitative: activity of alkaline phosphatase in group C (3.377±0.336) U/gprot was higher than in group A (2.537±0.083) U/gprot, B (2.843±0.060) U/gprot and D(2.063±0.061) U/gprot; the difference was statistically significant (P<0.05). PCR: expression level of ALP in four groups were highest on 7 d, and in group C was higher than in groups A, B and D (the difference was statistically significant,P<0.05); expression level of OCN in four groups were highest on 14 d, and in group C was higher than in groups A, B and D (the difference was statistically significant,P<0.05).Conclusions PLL - PTH (1-34) polyelectrolyte multilayer membrane can be made on implant material surface through layer by layer self-assemble technique. PTH (1-34) can release for a long time (14 d) by this technique, so as to promote proliferation and differentiation of the osteoblasts seeded on the surface.

PTH(1-34); polylysine; layer by layer self-assemble technique; implant

王星星，碩士研究生。

200433 上海，第二軍醫大學： 1.長海醫院口腔科，2.衛生統計學教研室

汪大林，E-mail:Wang_Dento@163.com

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