電離輻射反應中PML調控CXCR4的表達

樓煒　姚婉　樓敏銘　劉斌　宋宜

電離輻射反應中PML調控CXCR4的表達

樓煒姚婉樓敏銘劉斌宋宜

目的 觀察電離輻射反應中，肺癌細胞中受輻射感應分子早幼粒細胞白血病蛋白（PML）表達影響的信號分子，探討PML是否參與調控輻射誘導的腫瘤轉移過程。方法 本實驗采用特異性靶向PML的siRNA構建PML敲低表達細胞模型，鈷-60輻照，而后用康成公司的基因表達譜芯片檢測獲得差異表達基因，經聚類分析挖掘與細胞間通訊、腫瘤轉移有重要相關性的基因，進一步用反轉錄實時定量多聚酶鏈反應法（RT-qPCR）和蛋白質免疫印記法（WB）進行驗證。結果 應用基因表達譜芯片比較檢測電離輻射反應中受PML影響的基因，篩選獲得在非小細胞肺癌侵襲轉移中發揮重要作用的C-X-C細胞因子受體4（CXCR4）在PML敲低表達的非小細胞肺癌A549細胞中表達顯著上調；RT-qPCR和WB進一步在mRNA和蛋白水平驗證PML敲低細胞中CXCR4的表達增高。結論 在肺癌侵襲轉移中發揮重要功能的CXCR4基因的表達受輻射感應分子PML的調控。

早幼粒白血病蛋白 C-X-C細胞因子受體4 電離輻射 轉移

肺癌是當前世界范圍內發生率和致死率最高的惡性腫瘤［1］。臨床上除部分Ⅰ期非小細胞肺癌（NSCLC）患者采用單純手術治療外，其余各期NSCLC和小細胞肺癌（SCLC）患者多采取綜合治療策略。放射治療是肺癌治療的重要手段之一［2］，但近年的臨床及實驗室研究數據顯示當前采用的放射治療策略尚存在一些不足［3］。細胞在長期進化過程中形成的DNA損傷反應防御機制通過激活細胞周期檢查點、損傷修復、凋亡及非凋亡性死亡等細胞學反應維護細胞基因組穩定性，防止腫瘤發生［4］。早幼粒細胞白血病蛋白（PML）是細胞中的亞核多蛋白復合體PML核體的核心分子［5-6］。作者借助分子生物學研究方法，采用基因芯片技術，探討PML是否參與調控輻射誘發的腫瘤轉移。

1　材料與方法

1.1細胞培養、轉染及輻射條件 A549細胞系（人非小細胞肺腺癌）由軍事醫學科學院基礎醫學研究所邵寧生實驗室提供。細胞培養采用RPMI Medium 1640完全培養基（添加10%胎牛血清），于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。細胞轉染前1d（約18h）將細胞計數后接種于六孔板內，控制細胞密度使其轉染時的匯合率為70%～80%。將干涉序列1.5μl（20μmol/L）與轉染試劑（Polyplus）4.5μl置于100μl不含血清和抗生素的RPMI Medium 1640培養液中，輕柔混勻后室溫靜置20min，而后加入用雙無培養液預洗過的細胞共孵育，此時干涉序列的終濃度為30nmol/L，6h后更換含10%胎牛血清的完全培養基。轉染使用的干涉序列合成自吉瑪公司，具體如下：非特異序列轉染對照組：siNC ense：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT antisense：ACGUGACACGUUCGGAGAATT；特異性靶向PML序列組：siPML sense：GCAUCUACUGCCGAGGAUGTT antisense：CAUCCUCGGCAGUAGAUGCTT；輻射條件：鈷-60（Cobalt 60） 放射源，輻射劑量率為100.96 cGy/ min，輻射劑量10Gy。

1.2基因芯片檢測試劑及儀器 芯片檢測均交上海康成生物芯片有限公司備制實施。具體包括采用NanoDrop ND-1000進行樣本RNA定量、變性瓊脂糖凝膠電泳監測RNA完整性，而后用Invitrogen公司的雙鏈DNA合成試劑盒（Superscript ds-cDNA synthesis kit）將RNA反轉錄為雙鏈DNA，采用NimbleGen公司的DNA標記試劑盒（one-color DNA labeling kit）完成DNA的標記，繼而使用NimbleGen公司的芯片雜交和洗脫緩沖液試劑盒（NimbleGen Hybridization System and NimbleGen wash buffer kit）進行芯片的雜交并洗脫非特異結合，最后通過Axon GenePix 4000B芯片掃描裝置（Molecular Devices Corporation）掃描芯片雜交結果。

2　結果

2.1建立PML敲低表達A549細胞模型 為研究DNA損傷感應分子PML是否參與調控電離輻射誘發的腫瘤轉移機制，首先通過轉染特異性靶向PML基因的siRNA序列構建PML敲低表達A549人非小細胞肺腺癌細胞模型。通過反轉錄定量PCR和蛋白質免疫印跡法分別在mRNA和蛋白水平驗證了PML敲低表達細胞模型構建成功。

2.2基因芯片檢測及數據分析 在干涉序列轉染后48h，以放射性同位素鈷-60輻照對照組（NCsi）和PML敲低組（PMLsi）細胞，輻照后24h收集細胞，提取總RNA進行質量檢測（見圖1），繼而送康成公司完成mRNA芯片檢測和數據分析。其中，差異表達基因的GO數據庫聚類分析依據相關生物學過程（biological-process）、細胞組分（cellular-component）以及分子功能（molecular-function）對基因進行功能描述及分類。結果顯示：輻照后，大量參與細胞間通訊及信號傳遞的分子的表達在PML敲低的細胞中出現上調。共篩選發現有939個基因的mRNAs增高＞2倍，按GO數據庫聚類分析后依據分子功能（MF）對基因進行分類。表1中列出的為基因富集度最高的前5類功能及其代表基因。可見上調數量最多的前幾類分子功能均為具有細胞間及細胞內信號轉導功能的基因。而能夠正調控肺癌細胞輻射后增殖、遷移能力的重要細胞趨化因子受體CXCR4基因反復出現其中（見表1）。

圖1　PML基因敲低細胞表達譜的基因芯片檢測分析。樣本RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳（1 Ncsi組，2 Ncsi+IR組，3 PMLsi組，4 PMLsi+IR組）

表1　輻照后PML敲低表達肺癌細胞中mRNA表達上調高于對照細胞的基因功能分類表

2.3PML敲低表達的A549細胞在電離輻射后CXCR4的表達 分析表達組芯片數據，CXCR4在輻照后的PML敲低組細胞中的表達顯著增加。重新轉染、輻照、收集細胞，通過RT-qPCR反轉錄定量PCR（見圖2）和蛋白質免疫印跡（見圖3）檢測在mRNA和蛋白水平證實A549細胞中，PML的敲低表達導致趨化因子受體CXCR4表達上調。

圖2　qRT-PCR檢測細胞中的CXCR4基因mRNA表達情況圖3　蛋白免疫印跡檢測細胞中的CXCR4蛋白表達情況

圖2　qRT-PCR檢測細胞中的CXCR4基因mRNA表達情況圖3　蛋白免疫印跡檢測細胞中的CXCR4蛋白表達情況

3　討論

手術、放療、化療是當前治療惡性腫瘤的三大主要手段。隨著放射生物學和精準放療設備的不斷發展，放射治療在臨床腫瘤治療中的應用越來越廣泛，大約有60%的腫瘤患者會在不同治療階段接受放療。但近年來研究報道顯示電離輻射在抑制腫瘤細胞增殖并誘發腫瘤細胞凋亡性或非凋亡性死亡的同時，還能夠激活細胞內的其他信號轉導網絡，其會直接或間接地改變存活細胞的活性及所處微環境，使得存活腫瘤細胞的侵襲、轉移能力發生改變，并有可能導致放療誘發的腫瘤轉移，影響腫瘤放療的預后［7］。有關電離輻射誘發肺癌細胞侵襲遷移能力增強的現象國內外均已有大量研究報道，提示該過程的分子調控機制對臨床放療策略選擇及優化具有重要價值［8］。

CXCR4是已知的腫瘤組織中表達最普遍的趨化因子受體，在二十余種不同類型的腫瘤組織中的表達均異常增高。更重要的是，CXCR4的表達量還與患者的預后密切關聯。CXCR4及其配體的激活既能促進腫瘤細胞增殖抗凋亡，又能通過調節腫瘤細胞表面粘附分子的表達和活性誘導促進腫瘤發生侵襲轉移。本資料結果顯示，PML負調控腫瘤細胞內趨化因子CXCR4的表達，在通過分子生物學手段使得PML表達功能不足的情況下，受照后存活肺癌細胞中CXCR4的mRNA和蛋白表達水平均顯著增高。由于條件所限，本研究采用的腫瘤細胞輻照模型為單次輻照模型，盡管其引發的生物學效應與臨床放療類似（誘發腫瘤細胞周期阻滯、災變、凋亡），但照射劑量及形式與臨床多次分割輻照不同。因此，在今后的研究中還需進一步結合臨床樣本對PML與CXCR4的相關性進行更深入的研究討論。

本研究對PML的功能進行研究時采用的是敲低表達細胞中全部PML基因的A549細胞輻照模型。通過此模型發現PML參與調控腫瘤細胞輻射反應中CXCR4的表達。由于人類細胞中PML基因存在＞7個的變體，遠多于其他種屬的細胞，且各PML變體的功能各有不同，故今后的研究中還需進一步構建各個PML變體的表達載體，進一步開展針對不同變體的深入功能研究。

PML在發現之初即被歸為抑癌分子，能及時感應細胞中發生的DNA損傷，而后通過p53依賴和p53非依賴的途徑激活細胞周期檢查點、激活損傷修復，維持細胞的基因組穩定性，從而抗腫瘤發生。本資料結果表明PML還能夠抑制腫瘤細胞中侵襲轉移相關分子CXCR4的表達，進一步擴展了對PML抗腫瘤功能的認識。PML作為胞內亞核結構-PML核體（PML-NBs）的核心分子，其對CXCR4的調控有多種可能。PML既可能通過其下游的明星分子p53影響CXCR4的轉錄［9］，也可能通過與HDAC等遺傳調控蛋白的結合而調節CXCR4基因表達［10］。現有研究已證實特異性的CXCR4抑制劑具有抗腫瘤作用［11］，故進一步深入研究PML調控CXCR4表達的分子機制及和受PML調控的其他細胞間通訊及信號轉導分子將有望為研發腫瘤治療新靶標提供指導。

［1］Reboul FL.Radiotherapy and chemotherapy in locally advanced non-small cell lung cancer: preclinical and early clinical data. Hematol Oncol Clin North Am,2004,18(1): 41-53.

［2］Mullins K.Stereotactic body radiotherapy for earlystage nonsmall cell lung cancer: when and why is it appropriate therapy? J Adv Pract Oncol,2015,6(4): 351-354.

［3］高敏,張俊紅,周云峰,等.X線照射人肺腺癌細胞后侵襲和轉移能力變化及機制探討.中國放射腫瘤學雜志,2013,22(2):163-166.

［4］Goldstein M,Kastan MB.The DNA damage response:implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med,2014,66(1):129-143.

［5］Kurki S,Latonen L,Laiho M.Cellular stress and DNA damage invoke temporally distinct Mdm2,p53 and PML complexes and damagespecific nuclear relocalization. J Cell Sci,2003,116(Pt 19): 3917-3925.

［6］Salomoni P,Pandolfi PP.The role of PML in tumor suppression. Cell, 2002,108(2):165-170.

［7］Feys L,Descamps B,Vanhove C,et al.Radiation-induced lung damage promotes breast cancer lung-metastasis through CXCR4 signaling. Oncotarget,2015,6(29):26615-26632.

［8］Zhou YC,Liu JY,Li J,et al.Ionizing radiation promotes migration and invasion of cancer cells through transforming growth factorbeta-mediated epithelial-mesenchymal transition.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2011,81(5):1530-1537.

［9］Bao-Lei T,Zhu-Zhong M,Yi S,et al.Knocking down PML impairs p53 signaling transduction pathway and suppresses irradiation induced apoptosis in breast carcinoma cell MCF-7. J Cell Biochem, 2006, 97(3):561-71.

［10］Wu WS,Vallian S,Seto E,et al.The growth suppressor PML represses transcription by functionally and physically interacting with histone deacetylases. Mol Cell Biol,2001,21(7):2259-2268.

［11］Burger JA,Stewart DJ,Wald O,et al.Potential of CXCR4 antagonists for the treatment of metastatic lung cancer.Expert Rev Anticancer Ther,2011,11(4):621-630.

Objective To explore the role of PML in irradiation-induced tumor metastasis，and its down-stream targets involved in this process. Methods PML-knock-down cells were obtained by transfection of specific siRNAs. Total RNAs were isolated from cells after irradiation，and gene expression profiles were analyzed by DNA microarray（NimbleGen Human Gene Expression Microarrays）. We evaluated the mRNA expression of PML and CXCR4 with reverse transcription real-time polymerase chain reaction（RT-qPCR）. Western-blot examination to examine PML and CXCR4 protein expression was also carried out. Results DNA microarray analysis showed that CXCR4 gene expression was increased in PML-knock-down cells. The microarray data of CXCR4 mRNA levels were further validated using RT-qPCR. Increased CXCR4 protein levels in PML-knock-down cells were successfully confirmed correspondingly. Conclusions Decreased CXCR4 expression may be one of the mechanisms in PML-mediated irradiation-induced tumor metastasis.

PML CXCR4 Irradiation Metastasis

浙江省中醫藥科技計劃項目（2014ZB059），北京市自然科學基金課題（7152134）

310005 浙江中醫藥大學附屬第三醫院（樓煒）100850軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所（姚婉樓敏銘 劉斌 宋宜）

1.3芯片數據處理及分析 芯片掃描圖像導入NimbleScan軟件（版本2.6）進行數據分析。該軟件對導入數據行均一化處理后分別生成探針文件和檢測基因文件，而后將檢測基因文件導入Agilent GeneSpring GX軟件（version 11.5.1）分析，選取表達水平改變＞2倍的基因進行進一步的信號途徑分析和GO分析。

1.4反轉錄實時定量多聚酶鏈反應（RT-qPCR） 在A549細胞轉染后72h（其中一組48h 10Gy照射）提取細胞中的總RNA。步驟按照Trizol reagent總RNA提取試劑（康為世紀公司）說明進行。取1μg總RNA按照反轉錄試劑（ToYoBo公司）公司提供的標準操作過程反轉錄為cDNA。cDNA模板的定量PCR擴增采用Agilent Technologies Stratagene M×3000p系統，以SYBR Green dye為熒光染料。為確保各處理組間mRNA的等量性，實驗以GAPDH為內參。取1μl的cDNA作模板，混合10μl 2×UltraSYBR Mixture（with ROX）（康為世紀公司）及1 μl的引物（5μM）使總反應體系為20μl。QPCR擴增第一步95℃，10min，第二步95℃，15s和60℃，1min，共設定45個循環。

1.5蛋白質免疫印跡（Western-blot） RIPA全細胞裂解液（分子克隆）裂解細胞、蛋白定量，取適量蛋白樣品進行電泳（SDS-PAGE）。電泳后凝膠中的蛋白以180 mA恒流轉移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉/TBST緩沖液室溫封閉1h或4℃過夜；一抗PML（購自Santa公司）、CXCR4（購自NOVUS公司）均以1∶500稀釋，Actin（購自Bioworld公司）以1∶2000稀釋，室溫孵育2h或4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10min；辣根過氧化物酶標記二抗（購自三箭生物公司）以1∶2000稀釋，室溫反應1h，TBST洗膜3次，10min/次。加入顯色底物（Millipore）室溫孵育2min，暗室顯影。