CCL25/CCR9在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)研究

鐘萬(wàn)鍔　曹萍　許晶飛

CCL25/CCR9在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)研究

鐘萬(wàn)鍔曹萍許晶飛

目的 研究趨化因子CCL25，CCL25的受體CCR9在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）中的表達(dá)情況以及與UC病變程度和范圍的關(guān)系及相關(guān)性，探討其在UC發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)32例活動(dòng)期UC及22例正常對(duì)照石蠟包埋組織中CCL25及CCR9的表達(dá)情況。結(jié)果 UC組CCL25及CCR9均為陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)照組為陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)。CCL25及CCR9在UC組的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。UC病變范圍越廣、程度越重，CCL25及CCR9表達(dá)陽(yáng)性率越高，CCL25和CCR9表達(dá)具有相關(guān)性（r=0.759，P＜0.01）。結(jié)論 CCL25/CCR9相互作用參與了UC的發(fā)生和發(fā)展。CCL25/CCR9高低反映了疾病的炎癥程度，且可能作為藥物治療的潛在靶點(diǎn)。

潰瘍性結(jié)腸炎 CCL25 CCR9 免疫組織化學(xué)

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確且反復(fù)發(fā)作的慢性非特異腸道炎癥。目前認(rèn)為其發(fā)病可能與免疫、遺傳、感染及精神等多因素有關(guān)。腸道黏膜免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)所導(dǎo)致的炎癥在潰瘍性結(jié)腸炎中起重要作用。CCL25是CC類趨化因子家族成員，CCL25與CCR9相互作用調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的遷移。本文通過免疫組織化學(xué)的方法研究CCL25/CCR9在UC中的表達(dá)情況以及與病變程度的關(guān)系，探討CCL25/ CCR9在UC發(fā)病中的作用。

1　臨床資料

1.1一般資料 收集2013年10月至2014年11月在本院門診和住院患者中因腹痛、腹瀉、便血、腹脹及里急后重等行腸鏡檢查的患者32例，經(jīng)內(nèi)鏡和病理證實(shí)為潰瘍性結(jié)腸炎，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病協(xié)作組制定的IBD診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。其中男18例，女14例；年齡16～72歲，平均年齡42歲。均為疾病活動(dòng)期。按Sutherland疾病活動(dòng)指數(shù)進(jìn)行病情輕重分級(jí)［1］：輕度12例，中度15例，重度5例；按Baron評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行內(nèi)鏡分級(jí)［2］：Ⅰ級(jí)8例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)9例；按病變累級(jí)部位分為：直腸炎6例，直乙結(jié)腸炎16例，左半結(jié)腸炎7例，全結(jié)腸炎3例。對(duì)照組20例為性別年齡相匹配的健康志愿者（7例）和結(jié)腸息肉行腸鏡檢查者，標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確認(rèn)為正常腸黏膜。其中男13例，女7例；年齡15～17歲，平均年齡42歲，均來自于本院內(nèi)鏡室。所有觀察對(duì)象常規(guī)進(jìn)行腸道準(zhǔn)備，然后作腸鏡檢查，在病變最明顯處取組織2塊，立即置于10%的甲醛固定。健康志愿者和腸道腫瘤待行腸鏡檢查者均取正常腸黏膜2塊，立即置于10%的甲醛固定。制備組織切片，部分切片行 HE染色，光學(xué)顯微鏡下評(píng)價(jià)炎癥及潰瘍等組織學(xué)改變。另一部分用于檢測(cè)CCL25和CCR9的表達(dá)。

1.2方法 （1）免疫組化檢測(cè)步驟如下：檢測(cè)CCL25/ CCR9的免疫組化過程：標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，包埋成蠟塊，切成4～5μm的薄片。切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟，水化，抗原修復(fù)。每張切片加1滴3%的H2O2，室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗；加CCL25（工作濃度15μg/ml）及CCR9（工作濃度1：300）多克隆抗體，加二抗（工作濃度1：500），室溫下孵育30min。DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。陽(yáng)性結(jié)果判斷：光學(xué)顯微鏡下可見CCL25和CCR9表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞為棕黃色著色，背景為淡藍(lán)色。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物。采用以下染色積分評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［3］：染色強(qiáng)度分為4級(jí)：陰性染色（0分），弱陽(yáng)性染色（1分），中度陽(yáng)性染色（2分），強(qiáng)陽(yáng)性染色（3分）；每張切片按所見陽(yáng)性細(xì)胞范圍分為5級(jí)：陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占1%～25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞占26%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞占51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞占76%～100%為4分。每張切片的染色積分以這二者乘積之和表示。所用試劑：CCL25/CCR9多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司，均為兔源。羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson公司。免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司。

2　結(jié)果

2.1UC組、正常黏膜CCL25和CCR表達(dá)的比較 UC患者病變腸組織和對(duì)照組腸組織H-E染色情況見圖1。免疫組化染色情況見圖2。CCL25主要表達(dá)在腸道上皮細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜，CCR9表達(dá)在鄰近CCL25表達(dá)區(qū)域的淋巴細(xì)胞。在正常結(jié)腸黏膜組織中，CCL25和CCR9無(wú)或僅有弱陽(yáng)性表達(dá)。UC患者腸黏膜CCL25、CCR9表達(dá)水平分別為（4.38±1.64）和（4.78±1.96），均較對(duì)照組［分別為（0.66±0.52）和（0.72±0.46）］明顯升高，差異有顯著性（P＜0.01）。CCL25和CCR9在UC中的表達(dá)與炎癥程度正相關(guān)。

2.2CCL25、CCR9與UC病變程度之間的關(guān)系 CCL25、CCR9表達(dá)隨UC病情加重明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

圖2　A：UC患者病變腸組織見大量CCL25的表達(dá)（×400）；B：對(duì)照組腸組織無(wú)或僅有少量CCL25的表達(dá)（×400）；C：UC患者病變腸組織見大量CCR9的表達(dá)（×400）；D：對(duì)照組腸組織無(wú)或僅有少量CCR9表達(dá)（×400）

表2　CCL25、CCR9表達(dá)與UC病變程度的關(guān)系（±s）

表2　CCL25、CCR9表達(dá)與UC病變程度的關(guān)系（±s）

注：與輕度（Ⅰ級(jí)）比較，*P＜0.01；與中度（Ⅱ級(jí)），＃P＜0.01

因素nCCL25CCR9內(nèi)鏡分級(jí) Ⅰ級(jí)82.75±0.452.83±0.39Ⅱ級(jí)15 4.56±0.90*5.31±1.40*Ⅲ級(jí)9 6.86±1.46*#7.29±1.60*#病情輕重 輕122.85±0.382.92±0.49中154.57±0.76*5.07±1.00*重5 6.75±1.39*#7.50±1.60*#對(duì)照組200.66 ± 0.520.72 ± 0.46

2.3CCL25和CCR9相關(guān)性分析 根據(jù)內(nèi)鏡及病理分級(jí)，UC結(jié)腸黏膜組織中CCL25與CCR9蛋白的表達(dá)正相關(guān)（r=0.759，P＜0.01）。

3　討論

趨化因子是一類可誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有趨化吸引性的小分子蛋白質(zhì)，趨化因子通過其相應(yīng)受體對(duì)多種細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞等的趨化作用而在多種疾病的免疫反應(yīng)和炎癥損傷中發(fā)揮重要作用。趨化因子可分為CXC、CC、C、CX3C四個(gè)亞族，CCL25是新近發(fā)現(xiàn)的CC類趨化因子家族成員，CCL25由Vicari等［4］在人和小鼠的胸腺中發(fā)現(xiàn)，所以又稱胸腺表達(dá)調(diào)節(jié)趨化因子（Thymus-expressed Chemokine，TECK）。Zaballos等［5］研究證明CCR9是趨化因子家族CCL25的特異性受體。實(shí)時(shí)定量PCR研究發(fā)現(xiàn)，CCL25 mRNA主要表達(dá)于腸道上皮細(xì)胞和胸腺樹突狀細(xì)胞，在外周血單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞中也有表達(dá)，但表達(dá)水平不高。CCR9 mRNA主要表達(dá)于消化道歸巢的T淋巴細(xì)胞及胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的IgA分泌細(xì)胞表面［6-7］。

淋巴細(xì)胞歸巢是UC的病理特征之一，淋巴細(xì)胞歸巢離不開趨化因子的作用，UC通常是輔助性T細(xì)胞2（Th2）介導(dǎo)的腸道黏膜炎癥。CCL25和CCR9的相互作用主要調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的歸巢，CCL25通過上調(diào)整合素受體a4b7和CCR9調(diào)節(jié)腸效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的遷移［8-9］；CCL25通過CCR9趨化T淋巴細(xì)胞進(jìn)入結(jié)腸黏膜，成熟樹突狀細(xì)胞（mDC）可以激活T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)［10-11］。Wurbel等［12-13］通過葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型研究表明，CCL25和CCR9異常表達(dá)及其相互作用參與調(diào)節(jié)結(jié)腸炎癥反應(yīng)。Zhu等［14］通過惡唑酮小鼠結(jié)腸炎模型研究發(fā)現(xiàn)，CCL25及CCR9表達(dá)增加，CCL25與CCR9 相互作用調(diào)節(jié)并增強(qiáng)iNKT細(xì)胞的功能，進(jìn)而參與UC的發(fā)生。Rivera-Nieves 等［15］通過自發(fā)鼠類動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，在慢性回腸炎早期CCR9表達(dá)增多，給予抗體阻斷CCL25/CCR9能減輕早期慢性鼠類回腸炎。本資料結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCL25在UC組中陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)的強(qiáng)弱與炎癥程度成正相關(guān)，在對(duì)照組中不表達(dá)或僅有微弱的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CCR9作為CCL25的特異性受體，其表達(dá)情況與CCL25的表達(dá)情況相一致。CCL25和CCR9的表達(dá)具有相關(guān)性。CCL25與CCR9反映了疾病的炎癥程度，因而可作為病情程度監(jiān)測(cè)的有效指標(biāo)。

根據(jù)以上研究結(jié)果，作者認(rèn)為：CCL25和CCR9參與了UC的發(fā)生和發(fā)展。CCL25通過其受體CCR9趨化淋巴細(xì)胞聚集至病變結(jié)腸，并進(jìn)一步激活淋巴細(xì)胞，最終導(dǎo)致Th2介導(dǎo)的腸道黏膜炎癥。由于CCL25和CCR9在UC發(fā)病中起著重要作用，表達(dá)的強(qiáng)弱與炎癥程度成正相關(guān)，理論是可以將CCL25和CCR9作為治療的靶點(diǎn)，通過拮抗其活性將減輕炎癥損傷。由此可見，CCL25和CCR9在UC發(fā)病中起重要作用，聚集在病變結(jié)腸的淋巴細(xì)胞的激活直接導(dǎo)致了UC的病理變化。CCL25和CCR9反映了疾病的炎癥程度，可能成為潛在治療的靶點(diǎn)。

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Objective To investigate the role and the expression of chemokine CCL25and its receptor CCR9 in ulcerative colitis（UC）and to explore the relationship between CCL25 and CCR9 and the severity of disease. Methods The level of CCL25 and CCR9 in colon mucosa of UC patients was detected by immunohistochemistry method. Results The level of CCL25 and CCR9 in colon mucosa of UC patients were much higher than that of normal controls. The expressions of CCL25 and CCR9 were related to the extent of lesion and the degree of disease. The expression of CCL25 was significantly correlated with that of CCR9（r=0.759，P＜0.01）. Conclusions The expression of CCL25 is correlated with that of CCR9，CCL25 and CCR9 are closely related with the occurrence and development of UC. The expressions of CCL25 and CCR9 reflect the degree of inflammation of UC，and suggesting that CCL25 or CCR9 antagonism may represent a relevant pharmacological target for the design of novel pharmacological treatments in human UC.

Ulcerative colitis CCL25 CCR9 Immunohistochemistry

315040 浙江省寧波市第六醫(yī)院

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Stata13.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。CCL25和CCR9的相關(guān)性采用線性相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。