乳腺癌組織雄激素受體表達及其與啟動子甲基化的關系

王海，凌揚，盛桂鳳，劉永萍，周林艷，張亞平

(蘇州大學附屬常州市腫瘤醫院，a腫瘤內科,b臨床腫瘤實驗室,c病理科，常州 213000)

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乳腺癌組織雄激素受體表達及其與啟動子甲基化的關系

王海a，凌揚a，盛桂鳳a，劉永萍b，周林艷c，張亞平b

(蘇州大學附屬常州市腫瘤醫院，a腫瘤內科,b臨床腫瘤實驗室,c病理科，常州 213000)

目的 探討女性乳腺癌組織中雄激素受體(AR)的表達與啟動子甲基化的關系。方法 應用免疫組化和實時熒光定量PCR方法檢測38例乳腺癌組織中AR表達及其啟動子甲基化情況，并結合臨床病理資料進行分析。結果 乳腺癌組織中AR表達和年齡、淋巴結轉移、組織學分級、ER及HER-2表達無顯著相關性(P>0.05)；AR表達陰性組AR基因甲基化水平顯著高于陽性組(P=0.015)，患者年齡與AR基因甲基化水平呈負相關(r=-0.3486，P=0.0372)；淋巴結轉移、組織學分級及ER與AR基因甲基化無顯著相關性(P>0.05)。結論 AR表達陰性的乳腺癌患者AR基因甲基化水平較高。

乳腺腫瘤；受體，雄激素；甲基化

乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一[1]，約50%原發性乳腺癌的發生與性激素有關，20世紀 80年代，有學者提出乳腺癌是一種全身性疾病的生物學概念，使乳腺癌的治療原則發生了巨大的變革，由以往單純局部治療轉入局部與全身相結合的綜合治療時代。內分泌治療成為乳腺癌全身治療的主要方法之一。因此，雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)在乳腺癌的發生、發展和治療中具有十分重要的地位。近年來有研究報告雄激素受體(AR)常可和ER在乳腺癌中共表達，而且AR也可存在于通常被認為對性激素不敏感的ER陰性乳腺癌中[2-3]。表觀遺傳學是基于非DNA序列改變而產生的基因表達的變化，它與腫瘤的發生密切相關，具有可逆性和遺傳性，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和micro RNAs等，它們相互作用影響基因表達。在乳腺癌組織中ER基因存在異常高甲基化的情況，而對于AR基因甲基化的研究較少。

本研究采用免疫組化(IHC)及SYBR實時熒光定量PCR方法檢測乳腺癌組織中AR表達及AR 基因啟動子甲基化情況。分析了38例乳腺癌患者臨床病理資料，AR表達與甲基化的關系與臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 標本取自蘇州大學附屬常州腫瘤醫院2014年1月至2016年5月間經病理證實的乳腺癌患者，共38例，均為女性，平均年齡 (54.0±7.1)歲。淋巴結轉移陽性21例，陰性17例；組織學分級Ⅰ-Ⅱ級24例，Ⅲ級14例；ER陽性20例，陰性18例；HER-2陽性23例，陰性15例；

1.2 免疫組化 ①采用EnVision兩步法，石蠟包埋組織切片，常規脫蠟脫水，用3%H2O2去除內源性過氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液高壓抗原修復。一抗為兔抗人AR單克隆抗體(Abcam公司)孵育，孵育二抗，用已知陽性切片做陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固，光鏡觀察。 ②結果判斷：以細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性表達。按照陽性細胞數分為：無陽性細胞或著色細胞數<10%為陰性組(-)；著色細胞數≥10%為陽性組(+)。

1.3 實時熒光定量PCR檢測AR基因啟動子甲基化 ①乳腺癌組織標本DNA采用QIAmp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen公司)進行抽取；②DNA用亞硫酸氫鈉修飾和純化[4]；③根據文獻設計出針對亞硫酸氫鹽修飾后的AR基因甲基化與非甲基化引物序列，引物見表1。④SYBR實時熒光定量PCR，用不含有模板的反應體系作為陰性對照，將三蒸水作為空白對照，定量PCR反應結束后計算機自動繪制標準曲線，擴增曲線及溶解曲線，并給出所有樣品和標準品的閾值循環(Ct)及DNA拷貝數。反應條件見表2。

表1 AR基因引物序列

注：M：甲基化 U：非甲基化

表2 實時熒光定量PCR反應條件

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件，計量資料采用t檢驗，組間率的比較采用χ2檢驗，指標間相關性采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌AR蛋白表達和臨床病理學關系 AR陽性表達率79%(30/38)，陰性表達率21%(8/38)。乳腺癌組織AR表達免疫組化結果見圖1。AR表達和年齡、淋巴結轉移、組織學分級、ER及HER-2表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.2 乳腺癌AR基因甲基化與臨床病理學關系 AR陰性組AR基因甲基化水平顯著高于陽性組(P=0.015)，見表3，圖2；患者年齡與AR基因甲基化水平呈負相關(r=-0.349，P=0.037)；淋巴結轉移、組織學分級及ER與AR基因甲基化無顯著相關性(P>0.05)，見表4。

表3 AR表達和臨床病理資料的關系

注：()內數值為例數

表4 AR基因甲基化與各因素的相關性分析

3 討論

女性體內的雄激素包括由卵巢和腎上腺分泌的睪丸酮，由腎上腺分泌的雄烯二酮和脫氫表雄酮，流行病學研究提示絕經后女性血清雄激素高水平乳腺癌患病風險增加[5]。絕經后婦女卵巢功能衰竭，停止分泌雌激素，雌激素主要是在外周組織通過將腎上腺分泌的雄激素前體轉變而成，由下丘腦-垂體-腎上腺軸進行調控：下丘腦-垂體前葉分泌促腎上腺皮質激素-腎上腺皮質分泌雌激素(卵巢功能正常時分泌量少，當卵巢功能減退時分泌量增加)和雄激素。 絕經后腎上腺產生的雄激素在外周組織(包括脂肪、乳腺和肌肉等)中芳香化酶的作用下轉化成雌激素，這種轉化在外周組織細胞中進行，在原位發揮激素作用并在原位代謝，對循環中的激素水平幾乎沒有影響，血漿雌激素水平持續極低且波動很小，而局部乳腺組織中雌激素仍然維持高水平狀態，因此雄激素可通過間接地轉化為雌激素的途徑而發揮其作用。一方面雄激素能直接與雌激素協同刺激乳腺癌細胞的生長和增生，另一方面也可通過間接地轉化為雌激素的途徑而發揮其作用[6]。Micheli等[7]報道血清睪酮高水平組和低水平組相比較無瘤生存率明顯降低。復發轉移組乳腺癌患者血清睪酮水平明顯高于無復發轉移組[8-9]。據報道，乳腺癌手術后，ER和PR均陽性的乳腺癌內分泌治療的有效率為70%～80%，而ER和PR均陰性的乳腺癌內分泌治療的有效率不足10%，已完全脫離激素調控[10]。HU等[11]研究認為乳腺癌中AR表達與生存狀況的關系依賴于ER表達狀態，在ER陽性預后較好，而ER陰性患者中AR表達情況與乳腺癌生存率無明顯相關性。三陰性乳腺癌患者AR陽性具有較高的病死率，可能和雄激素是雌激素合成的前體物質，AR和ER信號傳導通路存在交互作用有關，AR可以抑制ER-α介導的乳腺癌細胞系的增長[12]。

表觀DNA異常甲基化在腫瘤發生發展中的意義已日益受到關注。DNA 甲基化是指在DNA甲基化轉移酶(DNMT)的作用下，將甲基基團轉移到DNA 分子上未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸中的胞嘧啶的 5′碳原子上。長度>200 bp 的 DNA 序列稱之為 CpG 島，CpG島常位于基因啟動子區，正常細胞的 CpG 島多處于非甲基化狀態，但在細胞發生癌變時某些抑癌基因啟動子區的 CpG島發生甲基化。啟動子區域的甲基化通常導致該基因的表達下調。Kim等[13]發現乳腺癌中ERβ基因的甲基化率達到50%。將DNMT抑制劑5-Aza-CdR去甲基化可以誘導乳腺癌ERβ表達增強或再表達[14]。乳腺癌中AR表達情況，各研究報道不一(31%～90%)，本組為79%，AR表達陽性率差異和各研究的研究對象不同有關。不同乳腺癌類型中AR表達陽性率差異很大[15]，浸潤性導管癌為56%，小葉癌為87%，后者不僅陽性率較高，而且陽性強度更高。

有研究[16]提示AR表達和ER、PR及HER-2表達正相關，與年齡、組織學分級呈負相關,提示AR表達程度越高，患者預后越好。另有試驗證明[17]檢測乳腺癌AR表達可作為獨立的指標來指導內分泌治療，為乳腺癌的雄激素拮抗劑治療效果判定提供依據。本研究提示AR表達和年齡、淋巴結轉移、組織學分級、ER及HER-2表達無明顯相關性，考慮和病理標本數量較少有關。AR基因的表達同樣受到表觀遺傳學調控[18]，本研究結果顯示AR陰性乳腺癌患者的AR基因甲基化率明顯高于AR陽性患者，DNMT抑制劑5-Aza-CdR能夠誘導乳腺癌細胞，同時恢復表達功能性的ERα和AR[19]，恢復了其對于激素的反應性及對于內分泌治療的敏感性。

本研究提示乳腺癌HER-2陰性組AR基因甲基化率明顯高于陽性組，隨著乳腺癌患者年齡的增大，AR基因甲基化水平明顯減低，這也解釋了老年乳腺癌患者預后較好，生存期較年輕患者長。總之，AR表達陰性乳腺癌患者中，AR基因甲基化明顯升高，去甲基化藥物治療仍需進一步研究，為AR陰性的乳腺癌患者找到一種新的治療方法。

(本文圖1，2見插圖6-1)

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Relationship between androgen receptor expression and its promoter methylation in patients with breast cancer

WangHai,LingYang,ShengGuifeng,LiuYongping,ZhouLinyan,ZhangYaping

(DepartmentofOncology,AffiliatedChangzhouTumorHospital,SoochowUniversity,Changzhou213000,China)

LingYang,Email:medilyn@vip.126.com

Objective To investigate the relationship between the expression of androgen receptor (AR) and promoter methylation in patients with breast cancer.Methods AR protein expression and promoter methylation status of 38 cases with breast cancer were detected by immunohistochemistry and real-time fluorescence quantitative PCR,and the clinical pathological data were analyzed.Results There were no significant correlation between AR expression and age,lymph node metastasis,histological grade,ER and HER-2 expression in breast cancer(P>0.05).The methylation level of AR gene in AR expression negative group was significantly higher than that in the positive group(P=0.015).The age of the patients was negatively correlated with the methylation level of AR gene(r=-0.3486，P=0.0372).There were no significant correlation between lymph node metastasis,histological grade,ER and AR gene methylation(P>0.05).Conclusion The methylation level of AR gene is significantly higher in patients with negative-AR breast cancer.

Breast neoplasms；Receptors,Androgen；Methylation

江蘇省科技廳臨床醫藥專項基金(BL2013012)；常州市科技計劃項目(CE20155043,CJ20159023)

王海，主治醫師，Email：wh81320@163.com

凌揚，主任醫師，教授，博士生導師，Email：medilyn@vip.126.com

R737.9

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.06.010

2016-07-04)