益氣養陰活血法對糖尿病大鼠肝臟P450的影響及其與血糖血脂的關系

程麗華，李中南，馬超，劉珊珊，熊園園，張帆

(1.安徽中醫藥大學，合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院)

?

·基礎研究·

益氣養陰活血法對糖尿病大鼠肝臟P450的影響及其與血糖血脂的關系

程麗華1，李中南2，馬超1，劉珊珊1，熊園園1，張帆1

(1.安徽中醫藥大學，合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院)

目的 探討益氣養陰活血法對糖尿病大鼠肝臟P450的影響及與血糖血脂的關系。方法 取大鼠55只，分為健康對照組，模型組，丹蛭降糖膠囊(DJC)高、低劑量組，吡格列酮組，除健康對照組外，其余動物給予高脂飼料喂養4周，按35 mg/kg，給大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液1次，造模成功后，DJC高、低劑量組分別給予1.08 g·kg-1·d-1、0.54 g·kg-1·d-1，吡格列酮組給予10 mg·kg-1·d-1，模型組、健康對照組給予等量0.9%氯化鈉注射溶液。均連續灌胃8周，留取肝臟，逆轉錄反應及實時熒光定量PCR檢測大鼠肝臟組織β-actin、P450，取血測定血糖、血脂、糖化血紅蛋白(HbA1c)。結果 與正常組比較，模型組大鼠肝臟P450表達明顯升高(P<0.01)，予DJC后顯著抑制了P450的過高表達，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。大鼠造模后血糖、血脂(TG)、HbA1c明顯升高(P<0.01)，予DJC后，高、低兩組血糖、血脂(TG)、HbA1c顯著下降(P<0.01或P<0.05)，療效與吡格列酮近似。P450與血糖、HbA1c相關分析顯示，均呈顯著正相關(P<0.01)；P450與血脂各項指標均無明顯相關性。結論 具有益氣養陰活血作用的丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠肝臟P450酶活性有顯著的抑制作用，有良好的降低血糖和血脂的作用，同時肝臟P450含量與血糖具有一定的相關性。

糖尿病，2型；益氣養陰；益氣活血；細胞色素P450酶系統;大鼠,Sprague-Dawley

細胞色素P450酶(CYP450)，是重要的藥物Ⅰ相代謝酶，可以催化藥物進行氧化、還原、水解等反應，在內源性和外源性物質的代謝中起著極其重要的作用[1-2]。同時CYP450酶的活性能被多種化合物誘導或抑制，改變其他藥物的代謝清除率，使藥物的代謝加快或減慢，從而引起藥物間的相互作用[3]。糖尿病狀態下，除了糖和脂質等物質代謝失衡外，P450s等藥物代謝酶的活性與其mRNA表達也產生了明顯變化，不僅造成多種藥物代謝改變，而且導致了睪丸酮、雌二醇、花生四烯酸等內源性物質的代謝紊亂，加重胰島素抵抗，并誘發糖尿病并發癥的發生發展。研究表明，肝臟P450酶活性變化在糖尿病疾病治療以及病情發展過程中占有重要地位[4]。本文通過實驗探討具有益氣養陰活血作用的丹蛭降糖膠囊(DJC)對糖尿病大鼠肝臟P450的影響，分析其與血糖血脂的相互關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 丹蛭降糖膠囊(DJC)，安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥物制劑中心提供，由太子參、丹皮、地黃、菟絲子、澤瀉、水蛭組成(0.35 克/粒)，鹽酸吡格列酮(杭州中美華東制藥有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司，批號:s0130)，DL2000 DNA Marke、6×Loading buffer(TaKaRa公司，批號：B7301A)，Trizol(Invitrogen公司批號：14105)、引物合成(Invitrogen)，DEPC(Sigma公司，批號：20130119215)，熒光定量PCR試劑盒(Thermo公司，批號：00145205)，QuantiFast SyBr Green PCR kit(Qiagen公司，Cat.No.204054)，核酸染料(賽百盛 GoldView公司，批號：130618)，氯仿、無水乙醇、異丙醇(上海蘇懿化學試劑有限公司，批號：20120320、20120320、20120210)。

1.1.2 動物 清潔級健康SD雄性大鼠55只，體質量(200±20)g，購自于安徽醫科大學實驗動物中心，許可證號:scxk(皖)2013。大鼠一般狀態良好，毛發茂盛有光澤，進食及活動正常，反應靈敏。

1.1.3 儀器 美國強生血糖儀(穩豪型)，全自動生化儀(日本株式會社，型號：日立7600)，西門子公司生產特定蛋白儀。普通PCR儀(杭州晶格科學儀器有限公司，型號：K960)、電泳儀(Tanon EPS 300型)、低速迷你離心機(海門市其林貝爾儀器制造有限公司LX 300型)、高速臺式冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司JW-3021HR)、萬分之一電子天平、微量移液器(德國Eppendorf)、紫外凝膠成像系統(北京科創銳新生物科技有限公司)、實時熒光定量PCR儀(Thermo PIKOREAL 96)、微孔板迷你離心機(杭州奧盛儀器有限公司，型號：MINI-P25)、PIKO Plate Illuminator(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組造模、給藥及處理 取SD雄性大鼠55只，適應性喂養7 d后，隨機選出9只作為健康對照組，予以基礎飼料喂養(蛋白質16%、脂肪8%、碳水化合物50%)。其余作為實驗組，給予高脂飼料進食(蛋白質14%、脂肪25%、碳水化合物51%，膽固醇5%)。高脂飼料喂養4周后，一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg(臨用前以pH 4.4的0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制)，120 h后尾靜脈采血，以隨機血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。造模成功后，將成模的糖尿病大鼠隨機分為模型組9只，吡格列酮組9只，DJC高劑量組10只，DJC低劑量組9只。按人與大鼠單位體質量折算系數給予吡格列酮組給予(10 mg/kg)灌胃，DJC高劑量組為(1.08 g/kg)，DJC低劑量組為(0.54 g·kg-1·d-1)，健康對照組和模型組予以0.9%氯化鈉注射溶液(5 mL/kg)，每天新鮮配置藥液，灌胃1次，連續8周。每兩周末尾靜脈采血測隨機血糖。實驗動物處死前禁食12 h，以3%水合氯醛10 mg/kg腹腔注射麻醉，取血測定糖化血紅蛋白(HbA1c)、血脂[包括三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-G)]。期間未成模動物3只，實驗中間因血糖過高死亡2只，皮膚感染死亡3只，動物互相打斗死亡1只。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測 Real time-PCR檢測大鼠肝臟組織P450 mRNA：大鼠麻醉后迅速取出肝臟，立即放入-80 ℃的液氮罐中保存。按照Trizol 試劑說明書提取大鼠肝臟組織總RNA。在0.2 mL EP管中，加入總RNA(3 μg)、10 μmol/L Oligo(dT)1 μL、DEPC水補足至12 μL，輕輕混勻、點動離心；在PCR儀上65 ℃加熱5 min后，立即冰浴3 min；再依次加入5×Reaction Buffer 4.0μL、10mmol/L dNTP Mix 2 μL、RNA酶抑制劑1 μL、逆轉錄酶1 μL；42℃反應60 min，70 ℃反應5 min去除逆轉錄酶 ；取出反應液，即為cDNA。熒光定量PCR反應體系(10 μL)：2×SYBR Green mixture 5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，RNase Free water 2 μL，反應條件為：95 ℃，5 min;進行40個PCR循環(95 ℃,10 s;60 ℃,30 s)，40個循環后進行溶解曲線步驟,最終擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,觀察有無非特異性擴增及擴增片段長度。Real time-PCR使用引物序列見表1。

表1 引物序列

注：F*表示上游引物(Forward primer)；R#表示下游引物(Reverse primer)

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，對照組和各給藥組之間差異的比較用t檢驗，采用Pearson相關分析考察兩變量間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P450及血糖、HbA1c灌胃后的結果 與健康對照組比較，模型組大鼠的P450水平顯著升高(P<0.01)；灌胃后，DJC高劑量組與吡格列酮組P450水平均明顯下降(P<0.01)；DJC低劑量組與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。模型組與健康對照組比較，血糖、HbA1c明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，DJC高、低組及吡格列酮組血糖、HbA1c均顯著下降(P<0.01)。P450與血糖、HbA1c的相關性分析顯示均具有相關性，其中，P450與血糖的相關系數為0.579(P<0.01)，P450與HbA1c的相關系數為0.795(P<0.01)。見表2。

表2 各組P450及血糖、HbA1c在灌胃后的結果

注：與健康對照組比較，aP<0.01；與模型組比較,bP<0.01，cP<0.05

2.2 對血脂各項指標的影響 與健康對照組比較，模型組的TG顯著升高(P<0.01)；予以DJC后，DJC高、低劑量組與吡格列酮組TG水平均明顯下降，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；DJC高劑量組與吡格列酮組療效相近。各組間TC、LDL-G及HDL-C水平均差異無統計學意義(P>0.05)。P450與血脂相關分析顯示，P450與血脂各項指標均無明顯相關性(P>0.05)。見表3。

表3 各組血脂在灌胃后的結果

注：與健康對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

2.3 溶解曲線及擴增曲線 見圖1。

3 討論

CYP450s又稱混合功能氧化酶，由一組結構相似、功能相關的血紅素蛋白基因超家族編碼，在機體內源性和外源性物質的生物轉化中發揮著重要作用。CYP450酶系的表達受基因型、性別、年齡、藥物和環境的影響，病理狀態下CYP450酶系也會發生變化[5-6]。糖尿病狀態對CYP450酶系各亞型可在不同水平產生誘導或抑制，從而干擾多種藥物的正常代謝，進一步影響藥物作用強度及持續時間，最終引發毒性反應。相關實驗證實，腹腔注射STZ誘導的糖尿病大鼠，其CYP450總酶含量升高，由此推斷，糖尿病狀態下藥物代謝所發生的變化，可能與肝臟I相藥物代謝酶CYP450酶系的變化密切相關[7-8]。本實驗中注意到，造模后，與健康對照組比較，模型組大鼠P450總酶含量指標明顯升高(P<0.01)，提示糖尿病狀態下，大鼠肝臟CYP450酶系活性被誘導，酶總含量升高。灌胃DJC 8周后，肝臟過高的P450酶系活性被下調，其表達量明顯下降(與模型組比較，P<0.01)，提示DJC對糖尿病大鼠肝臟P450有抑制作用。

其次發現，造模后，模型組P450含量升高的同時，其血糖、血脂(TG)及HbA1c明顯升高(P<0.01)；予DJC后，高低劑量組血糖、血脂(TG)顯著下降(P<0.01)，而其P450表達量也隨之下降。相關分析顯示，血糖與肝臟P450含量密切相關，驗證了糖尿病大鼠血糖異常表達與肝臟CYP450酶系活性被誘導有關。敲除 CYP2E1基因可增強小鼠脂肪組織對葡萄糖的攝取能力，同時提高胰島素對肝糖原分解的抑制能力，從而明顯改善小鼠的葡萄糖耐受[9]。糖尿病狀態下，伴隨著P450 酶活性的誘導，由P450 酶系介導氧化還原反應產生的活性氧自由基(ROS)顯著增加。研究表明，高濃度的ROS或長期暴露ROS，能夠損傷胰島素信號通路，引起細胞的胰島素抵抗，從而使血糖升高[10]。P450酶活性被誘導所產生的大量ROS可能是造成糖代謝紊亂、血糖升高的重要原因。本研究發現DJC對糖尿病大鼠肝臟P450酶有調整作用，與其降糖作用關系密切。同時，實驗結果進一步說明DJC對血脂的影響是明確的，結合以往研究發現[11]，DJC能夠降低三酰甘油水平，改善脂質代謝紊亂，減輕脂毒性對內皮細胞功能的損害。相關性分析顯示，血脂與肝臟P450總酶含量無明顯相關性，提示DJC對糖尿病大鼠肝臟P450的調整作用與其調節血脂作用無關。

綜上所述，具有益氣養陰活血作用的DJC能夠調整糖尿病大鼠肝臟P450含量，降低血糖，調節血脂，從而保護胰島素信號通路，改善糖代謝紊亂，糾正胰島素抵抗，抗炎性因子[12]。進一步證實了本方能夠多途徑、多靶點綜合治療糖尿病，調節整體功能狀態。

(本文圖1見插圖6-2)

[1] XU Y,WANG L,HE J.et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J].JAMA,2013,310(9):948-959.

[2] SCHNEIDER E,CLARK DS.Cytochrome P450(CYP)enzymes and the development of CYP biosensors[J].Biosens Bioelectron，2013，39(1):1-13.

[3] 梁淼,馬增春,易劍鋒，等.四物湯及其配伍對大鼠肝臟P450酶活性及mRNA表達的影響[J].中國中藥雜志，2013,38(21):3720-3724.

[4] PACHECO MA,PASTOOR TE,LUKAS RJ,et al.Characterization of Human α4β2 neuronal nicotinic receptors stably expressed in SH-EP1 cells [J].Neurochem Res,2001,26(6):683-693.

[5] TALALAY P.Chemoprotection against cancer by induction of phase 2 enzymes[J].Biofactors,2000,12(1):5-11.

[6] CHENG PY,MORGAN ET.Hepatic cytochrome P450 regulation in disease states[J].Curr Drug Metab,2001,2(2):165-183.

[7] GUENGERICH P.Catalytic selectivity of human cytochrome P450 enzymes:relevance to drug metabolism and toxicity[J].Toxicol Lett,1994,70(2):133-138.

[8] SHIMOJO N.Cytochrome P450 changes in rats with streptozocin-induced diabetes[J].Int J Biochem,1994,26(10/11):1261-1268.

[9] ZONG H,ARMONI M,HAREL C,et al.Cytochrome P-450 CYP2E1 knockout mice are protected against high-fat diet-induced obesity and insulin resistance[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2012,302(5):532-539.

[10] KUMASHIRO N,TAMURA Y,UCHIDA T,et al.Impact of oxidative stress and peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1alpha in hepatic insulin resistance[J].Diabetes,2008,57(8):2083-2091.

[11] 李中南,方朝暉,張帆,等.丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠腎組織骨橋蛋白的影響[J].中醫雜志,2015,56(9):788-791.

[12] 李中南，方朝暉，熊圓圓,等.丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠肝臟PI3K/AKT信號通路的影響[J].上海中醫藥雜志,2015,49(9):67-70.

Influence of Tonifying Qi,nourishing Yin and activating blood method on the cytochrome P450 in the liver and its relationship with glucose and lipid

ChengLihua*,LiZhongnan,MaChao,LiuShanshan,XiongYuanyuan,ZhangFan

(*AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230038，China)

LiZhongnan,Email：LZN5151307@sohu.com

Diabetes mellitus,Type 2；Reinforcing Qi Nourishing Yin；Reinforcing Qi Activat Blood；Cytochrome P-450 enzyme system;Rats,sprague-dawley

國家中醫臨床研究基地業務建設科研專項(JDZX2012004)

程麗華,碩士在讀，Email：dalihua187@163.com

李中南，主任醫師，Email：LZN5151307@sohu.com

R587.1

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.06.021

2016-06-18)

[Absract] Objective To explore the influence of Tonifying Qi,nourishing Yin and activating blood method on the cytochrome P450 in the liver of diabetic rats and its relationship with blood glucose and blood lipid.Methods Fifty-five rats were randomly divided into 4 groups:normal control group,model group,high-and low-dose Danzhi Jiangtang Capsule groups,and pioglitazone group.Except the control group,all others groups were fed with high-fat diet for 4 weeks,then gave diabetic model rats intraperitoneal injection with streptozotocin(STZ) of 35 mg/kg once only.The rats of high-dose DJC and low-dose DJC group were treated with DJCof 1.08 g·kg-1·d-1,0.54 g·kg-1·d-1respectively,pioglitazone group was treated with pioglitazone of 10 mg·kg-1·d-1,the normal control group and model group were given saline 5 ml·kg-1·d-1.After modeling,continuously administrate drug by drenching for 8 weeks,then put them to death and get the liver to do the tests of p450 and β-actin by the Real-Time PCR.Meanwhile,we measured the glucose,lipid and HbA1c.Results Compared with the normal group,the expression of p450 in the model group increased significantly(P<0.01),the overexpression of p450 was significantly inhibited by DJC.compared with model group,the difference has statistical significance(P<0.01).After the model established,the level of glucose,lipid and HbA1c were significantly increased(P<0.01),while the level of glucose,lipid and HbA1c of high-dose DJC and low-dose DJC group were dacreased significantly.The effect of high-dose DJC and low-dose DJC were similar to pioglitazone group(P<0.01 orP<0.05).The correlation analysis showed that there was a significant positive correlation among P450 and blood glucose,HbA1c.There was no significant correlation between P450 and lipid(P<0.01).Conclusion Danzhi Jiangtang Capsule can inhibit the activity of p450 enzyme in the liver of diabetic rats and reduce the blood glucose and lipid.Meanwhile,the P450 of liver and glucose is correlated.