玻璃體腔注射VAS2870對小鼠氧誘導視網膜病變的保護作用

郝艷芳，朱巧平，謝安明

?

·實驗論著·

玻璃體腔注射VAS2870對小鼠氧誘導視網膜病變的保護作用

郝艷芳1,2，朱巧平1,2，謝安明1

1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China;2Department of Ophthalmology, the First Hospital of Yulin, Yulin 719000, Shaanxi Province, China

?METHODS: Neonatal C57BL/6J mice were divided randomly into three groups: normoxic control group, PBS injection of OIR group and VAS2870 injection of OIR group. The mice of the latter two groups were exposed to 75% oxygen from the postnatal 7d (P7) to the postnatal 12d (P12) to induced OIR. VAS2870 was administered by intravitreal injection (0.5μL) in a mice model of OIR in P12. Another set of mice model of OIR were received a similar treatment with PBS. All eyes were collected at P17. The right eyes were whole mounted and stained with Lectin to observe the growth of retinal vessels; The eyes were enucleated to assess the levels of reactive oxygen species ROS/RNS. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and Nox4 mRNA were detected by western blot and RT-PCR, respectively.

?RESULTS: In the retina of OIR, VAS2870 reduced the retinal avascular area and neovascularization, the hypoxia-induced increase in ROS levels, the protein expression of VEGF and gene expression of Nox4 mRNA.

?CONCLUSION: NOX4 enzyme inhibition with VAS2870 has potent anti-oxidative stress effects in the retina, indicating its potential as a treatment for retinopathy of prematurity.

目的：觀察玻璃體腔注射VAS2870對C57小鼠氧誘導視網膜病變的影響。

方法：將新生C57BL/6J小鼠隨機分為3組，分別為正常對照組、VAS2870注射OIR組和無菌PBS緩沖液注射OIR組。將后兩組小鼠在出生后第7d(P7)至P12置于體積分數為75%±2%的恒定高氧氧箱中以構建OIR模型，在P12時給予幼鼠雙眼玻璃體腔注射VAS2870(0.5μL)，另一組幼鼠雙眼注射同等劑量的無菌PBS緩沖液。三組小鼠均在P17時取右眼行視網膜鋪片和Lectin染色，觀察視網膜中央無血管區及病理性新生血管的情況；取右眼行視網膜組織定量檢測ROS/RNS含量；取左眼應用RT-PCR檢測Nox4 mRNA含量，并應用Western-blot測定視網膜組織中VEGF的表達。

結果：VAS2870注射OIR組小鼠視網膜中央無血管區面積較無菌PBS緩沖液注射OIR組明顯減少(P<0.05)，病理性新生血管數目明顯減少(P<0.05)；VAS2870注射OIR組小鼠視網膜組織Nox4 mRNA的表達量明顯低于無菌PBS緩沖液注射組；VAS2870注射OIR組小鼠視網膜組織ROS含量較無菌PBS緩沖液注射組明顯降低(P<0.05)；VAS2870注射OIR組小鼠視網膜組織VEGF的表達明顯低于無菌PBS緩沖液注射組(P<0.05)。

結論：在小鼠OIR模型中，VAS2870可抑制Nox4 mRNA的表達，減少ROS/RNS，下調VEGF的生成，在視網膜病變進程中具有保護作用。

VAS2870；氧誘導視網膜病變；氧自由基；血管內皮生長因子

引用：郝艷芳，朱巧平，謝安明.玻璃體腔注射VAS2870對小鼠氧誘導視網膜病變的保護作用.國際眼科雜志2016;16(12):2200-2203

0引言

早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是一種多發生于早產兒或低體重嬰幼兒的視網膜增生性病變，與出生后暴露于波動氧誘導未發育成熟視網膜血管的收縮和閉塞形成無血管區并繼發病理性新生血管大量生成有著密切關系，后期可引起視網膜脫離，嚴重危害患兒的視力[1]。雖然在防治方面取得一些進展，但該病變一旦發生，進展很快，可有效治療的時間窗口很窄，仍無法有效地阻止病變的進展。目前針對視網膜病變進展的基本發病機制為靶點的治療已成為新的戰略[2]。在ROP的病理過程中，視網膜暴露于不斷波動的氧分壓中，引起視網膜缺血缺氧，產生過量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)/活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)，可直接對視網膜血管造成損傷。NADPH氧化酶是血管內皮細胞ROS/RNS的主要來源，在外來信號刺激下激活或失活，從而迅速升高或降低細胞內的ROS/RNS水平[3]。Nox4是NADPH氧化酶家族中的一員，在人視網膜血管內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞中高度表達[4]。Nox4是一種多效性信號肽，可通過多種信號通路發揮多樣的功能，包括細胞生長和分化、血管壁重塑、血管發生和腫瘤生長[5]。然而，目前有關Nox4在氧誘導視網膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)模型中的作用尚不完全清楚，本研究擬使用Nox4特異性抑制劑VAS2870，給予高氧波動中的C57BL/6J新生幼鼠雙眼玻璃體腔注射，觀察幼鼠視網膜病變的發生情況，為ROP的防治提供新的治療方向。

1材料和方法

1.1材料 新生C57BL/6J小鼠(西安交通大學實驗動物中心提供)共96只，按照隨機原則選取64只為OIR組，另32只正常對照組。OIR組新生小鼠隨機分為VAS2870注射OIR組和無菌PBS注射OIR組，每組各32只。每組新生幼鼠與母鼠同籠飼養直至造模完成，按照實驗動物中心SPF級動物實驗室飼養，晝夜比12h∶12h，溫度控制(24±1)℃，濕度為50%～60%。

1.2方法

1.2.1小鼠OIR模型的建立 參照小鼠OIR模型建立方法[6]，在出生后第7d(P7)，將新生C57BL/6J小鼠與母鼠共同置于體積分數75%±2%的恒定高氧箱中飼養，常規食水供應，在P12返回正常空氣中繼續飼養。正常對照組小鼠則置于正常空氣中飼養。

1.2.2小鼠玻璃體腔注射 在P12返回正常空氣中取幼鼠稱重后，4.3%水合氯醛(0.01mL/g，腹腔注射)麻醉后使用復方托吡卡胺散大兩側瞳孔，生理鹽水濕潤眼表，左氧氟沙星滴眼，使小鼠側臥在手術臺，在解剖顯微鏡下撥開眼瞼，暴露角鞏膜緣。使用10-0針在角鞏膜緣后1mm做切口，33G注射器刺入玻璃體腔，注射0.5μL的VAS2870，對照組注射無菌PBS 0.5μL。術后紅霉素眼膏涂眼預防感染。

1.2.3小鼠視網膜鋪片Lectin染色及圖像分析 造模結束后(P17)，使用1%戊巴比妥鈉(30mg/kg，腹腔注射)過量麻醉處死幼鼠，取右眼置于4%多聚甲醛4固定。在手術顯微鏡下用角膜剪沿眼球的角鞏膜剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體及玻璃體，分離視網膜。分離的視網膜組織于4%多聚甲醛溶液固定3h，用PBS(0.01mol/L，pH：7.4)漂洗5min，用1%牛血清白蛋白+0.5% Triton+0.01mol/L PBS在室溫中封閉2.5h，加入抗體Isolectin B4過夜，用PBS漂洗5min×3次后在手術顯微鏡下以視盤為中心，放射狀切開視網膜，平鋪于載玻片上，樹脂膠封片。

1.2.4 RT-PCR測定各組小鼠視網膜組織Nox4 mRNA表達量 造模結束后(P17)，以上述實驗方法分離得到視網膜，按照Trizol試劑盒說明書提取視網膜總RNA，逆轉錄反應按照Promega公司試劑盒提供的實驗程序完成。PCR引物序列：Nox4：正向序列：5’-CAG GAG GGC TGC TGA AGT ATC AA-3’和反向序列：5’-TGA CTG GCT TAT TGC TCC GGA TA-3’。GAPDH：正向序列：5’-TCT GGA AAG CTG TGG CGT G-3’和反向序列：5’-CCA GTG AGC TTC CCG TTC AG-3’。檢測幼鼠視網膜組織中Nox4 mRNA的表達量。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)測定各組小鼠視網膜組織VEGF表達量 造模結束后(P17)，取眼球分離小鼠視網膜組織后置于細胞裂解液(1% Triton X-100，50mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，0.1% SDS，1%脫氧膽酸鈉)中勻漿。BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳、轉膜。加入一抗，室溫孵育12h，HRP標記的二抗室溫孵育2h。ECL顯影后，半定量分析視網膜組織中VEGF條帶的光密度值。

1.2.6高質熒光測定各組小鼠視網膜組織氧化應激活性氧(ROS) 造模結束后(P17)，取眼球分離視網膜后用預冷的GENMED清理液漂洗2～3次；視網膜組織加入100μL GENMED稀釋液，漩渦混合器充分震蕩充分混勻后移取50μL組織勻漿物或50μL GENMED稀釋液(背景對照)到96孔平板上，加入950μL GENMED染色液和GENMED稀釋液的染色工作液，充分混勻后放37℃恒溫水孵育20min，避免光照。隨后使用避熒光定量分光光度儀(M5)檢測：激發波長490nm，散發波520nm。對比OIR模型組ROS熒光度/常氧對照組ROS熒光強度值。

1.2.7圖像觀察 熒光顯微鏡下拍攝視網膜血管染色圖像，應用Adobe Photoshop CS6合成視網膜全圖，參照Connor等[7]分析方法選取視網膜無血管區、病理性新生血管和視網膜總面積(以像素為單位)，分別計算無血管區和病理性新生血管與視網膜總面積比值。

2結果

2.1三組小鼠視網膜血管化情況 三組小鼠視網膜血管染色鋪片顯示，在P17時，正常對照組小鼠視網膜血管化已經完成，血管走形規則，分支良好(圖1A)；兩組小鼠OIR模型構建成功，VAS2870注射OIR組和無菌PBS注射組小鼠視網膜中央均出現程度不同的無血管化區域(綠色線標出區域，圖1B～C)以及呈團簇狀的新生血管(白色箭頭所指，圖1B～C)。統計分析顯示：VAS2870注射OIR組小鼠視網膜中央無血管區面積顯著減少(t=8.393，P<0.05)，病理性新生血管數目減少，差異有統計學意義(t=3.014，P<0.05，表1)。

2.2三組小鼠視網膜組織Nox4 mRNA表達情況 RT-PCR結果顯示，在P17時正常小鼠視網膜組織中有少量Nox4 mRNA表達；兩組OIR模型組中小鼠視網膜組織Nox4 mRNA的表達量明顯升高。統計分析顯示，三組間小鼠視網膜Nox4 mRNA的表達量差異存在統計學意義(F=151.98，P<0.05)，VAS2870注射OIR組和無菌PBS緩沖液注射組小鼠視網膜Nox4 mRNA的表達量均明顯高于正常對照組(均P<0.05)，而VAS2870注射OIR組小鼠視網膜Nox4 mRNA的表達量明顯低于無菌PBS注射組，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

圖1 三組小鼠視網膜血管染色鋪片圖(×400) A：常氧對照組；B：無菌PBS注射OIR模型組；C：VAS2870

注射OIR模型組。

表1 OIR模型小鼠視網膜無血管區以及病理性新生血管像素百分比

(±s，%)

注：aP<0.05vsPBS注射OIR組。

2.3三組小鼠視網膜組織VEGF表達情況 Western blot結果顯示：兩組OIR模型組中小鼠視網膜組織VEGF的表達量明顯升高。統計分析顯示，三組間小鼠視網膜VEGF表達量的差異存在統計學意義(F=102.703，P<0.05)，VAS2870注射OIR組和無菌PBS緩沖液注射組小鼠視網膜VEGF表達量均明顯高于正常對照組(均P<0.05)，而VAS2870注射OIR組小鼠視網膜VEGF表達量明顯低于無菌PBS注射組，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

2.4三組小鼠視網膜組織ROS生成情況 在P17時，正常小鼠視網膜組織中有少量的ROS生成；兩組OIR模型組小鼠視網膜組織中ROS生成量均明顯增加。統計分析顯示，三組間小鼠視網膜ROS生成量差異存在統計學意義(F=86.856，P<0.05)，VAS2870注射OIR組和無菌PBS緩沖液注射組小鼠視網膜ROS生成量均明顯高于正常對照組(均P<0.05)，而VAS2870注射OIR組小鼠視網膜ROS生成量明顯低于無菌PBS注射組，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

3討論

視網膜組織代謝活躍、氧含量及耗氧量高、不飽和脂肪酸含量高，且經常暴露于可見光下，對活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)/活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)的損傷敏感[8]。研究顯示，在出生后早產兒未發育成熟的視網膜暴露于外界不斷波動的氧分壓(高氧低氧相交替)中，導致視網膜局部缺血缺氧，引發過量的ROS/RNS生成，過量生成的自由基具有直接細胞毒性，損傷正常的血管內皮細胞，導致氧化應激損傷，使正常生長發育的視網膜血管停滯，并繼發生成病理性新生血管，嚴重者可牽拉引起視網膜脫離。因此，氧化應激在ROP的病理進程中扮演著重要的作用[9]。

表2 三組小鼠視網膜Nox4 mRNA表達量

±s

注：aP<0.05vs正常對照組；cP<0.05vsPBS注射OIR組。

圖2 三組小鼠視網膜組織VEGF蛋白表達水平的免疫印跡結果 A：蛋白印記條帶；B：VEGF蛋白表達的條形圖。

圖3 三組小鼠視網膜組織ROS熒光強度相對值。

在OIR模型中的研究顯示，視網膜局部缺血缺氧可活化NADPH氧化酶，引起局部ROS/RNS升高，從而上調VEGF表達、促進血管內皮細胞凋亡、促進視網膜無血管區和病理性新生血管的形成，而注射夾竹桃麻素抑制NADPH氧化酶的活性后可減少視網膜無血管區及病理性新生血管的形成[10-11]。進一步的研究顯示，NADPH氧化酶家族的亞單位參與了內皮細胞的功能調節和血管發生的調控。Nox家族組包括7個成員，分別為Nox1，Nox2，Nox3，Nox4，Nox5，Duox1和Duox2。在血管系統，Nox1，Nox2，Nox4和Nox5均有表達，Nox4在人視網膜血管內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞中高度表達[12]。

在實驗中我們發現，在兩組幼鼠OIR造模成功后，視網膜中心均形成明顯的無血管區，周邊視網膜繼發形成病理性新生血管，且在視網膜組織Nox4 mRNA的表達量、ROS/RNS生成量及VEGF的表達也較正常對照組明顯增加。在P12使用VAS2870特異性抑制Nox4活性后，幼鼠視網膜中心的無血管區較PBS組明顯減小，病理性新生血管的數量也減少，視網膜組織中Nox4 mRNA的表達量下降，ROS/RNS生成量及VEGF的表達量均明顯下降，說明在小鼠OIR模型中，視網膜缺血缺氧可活化Nox4，促進視網膜無血管區以及病理性新生血管的形成，而抑制Nox4活性可減輕視網膜血管的病變。

前期研究顯示在低氧培養的血管內皮細胞中可檢測到Nox4 mRNA表達增加，且血管內皮細胞增生、移行形成管腔也明顯增加，而在低氧培養的Nox4基因敲除小鼠內皮細胞中所形成的管腔明顯減少，且用藥物抑制Nox4活性后，可減少缺氧組織中新生血管的密度[13-14]。在其他缺血/缺氧誘導的新生血管模型中，在內皮細胞Nox4過量表達的轉基因小鼠上臂缺血組織中主動脈毛細血管萌芽增加[15]。總之，這些研究都說明內皮細胞Nox4可促進缺血缺氧狀態下的血管發生，抑制Nox4活性后可減少新生血管的形成[16]。

綜上所述，本實驗結果表明在小鼠氧誘導視網膜病變模型中VAS2870可抑制Nox4活性，減少ROS/RNS的生成，下調VEGF的表達從而發揮視網膜保護作用，可能成為治療的潛在靶點。

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Protection of VAS2870 to oxygen-induced retinopathy in mice

Yan-Fang Hao1,2, Qiao-Ping Zhu1,2, An-Ming Xie1

An-Ming Xie.Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China. Xie9102@163.com

?AIM: To investigate the protective effect of VAS2870 on mice oxygen-induced retinopathy (OIR) and the possible underlying mechanisms.

VAS2870; oxygen-induced retinopathy; reactive oxygen species; reactive nitrogen species; vascular endothelial growth factor

1(710061)中國陜西省西安市，西安交通大學第一附屬醫院眼科；2(719000)中國陜西省榆林市第一醫院眼科

郝艷芳，在讀碩士研究生，主治醫師，研究方向：眼底病。

謝安明，主任醫師，碩士研究生導師，研究方向：眼底病.Xie9102@163.com

2016-07-02

2016-11-03

:Hao YF, Zhu QP, Xie AM. Protection of VAS2870 to oxygen-induced retinopathy in mice.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(12):2200-2203

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.12.07

Received：2016-07-02 Accepted：2016-11-03