JNK信號通路活化與BCMA表達對MM細胞的作用研究

徐 光，班永宏，鞠少卿，朱寶立△

(1.江蘇省疾病預防控制中心，南京 210028；2.江蘇省南通大學附屬醫院醫學檢驗中心 226001)

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·論 著·

JNK信號通路活化與BCMA表達對MM細胞的作用研究

徐 光1，班永宏1，鞠少卿2，朱寶立1△

(1.江蘇省疾病預防控制中心，南京 210028；2.江蘇省南通大學附屬醫院醫學檢驗中心 226001)

目的 研究多發性骨髓瘤(MM)細胞中B細胞活化因子(BAFF)及B細胞成熟抗原(BCMA)的表達及作用，JNK信號通路的表達及活化情況，探討JNK信號通路活化與BCMA表達間的相互作用。方法 采用實時熒光定量(QRT)-聚合酶鏈式反應(PCR)檢測MM患者及健康對照者單核細胞(PBMCs)中BAFF及其受體BCMA、TACI、BAFF-R的表達。采用Western Blot方法檢測MM細胞中BCMA蛋白的表達及信號通路蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38及p-p38的表達及活化情況；采用WST-1法檢測MM細胞的增殖與存活。結果 MM患者PBMCs中BAFF及BCMA的表達顯著高于健康對照者。人BAFF重組體(rhBAFF)促進MM細胞的增殖，Si-BCMA可抑制rhBAFF對MM細胞的增殖作用。除了ERK、JNK及p38的表達外，MM細胞中還有活化蛋白p-JNK的表達。Si-BCMA可下調p-JNK的表達，JNK信號通路抑制劑可下調p-JNK及BCMA的表達。結論 MM細胞中，BAFF通過BCMA促進MM細胞增殖。JNK信號通路活化與BCMA表達相互作用，共同促進MM細胞的增殖與存活。

多發性骨髓瘤； B細胞活化因子； B細胞成熟抗原； JNK信號通路

多發性骨髓瘤(MM)是常見的B細胞惡性腫瘤，以骨髓中異常漿細胞的過度增生、骨損傷及免疫缺陷為特征。盡管近年來MM的治療取得了顯著進步，但其平均5年存活率及10年存活率僅為32%及3%，仍然不可能完全治愈MM。研究證實，細胞因子白細胞介素(IL)-6、IL-10、干擾素(INF)-α、B細胞活化因子(BAFF)等促進MM細胞生長及介導細胞耐藥[1-2]，且BAFF的表達影響MM細胞的存活、增殖、轉移及耐藥[3]。

BAFF是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員之一，屬Ⅱ型跨膜蛋白，通過與B細胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物(TACI)、BAFF受體(BAFF-R)結合來調節B細胞的活化、增生和分泌[4-5]。異常的BAFF表達可調節MM細胞的增殖，表明其受體在促進腫瘤生長的過程中發揮一定作用。有研究報道，BAFF-R是B細胞發生及存活的主要受體，TACI在調節B細胞穩態及自身免疫方面起重要負調控作用，而MM標本中BCMA的持續表達表明BCMA可作為調控惡性漿細胞促存活途徑的主要受體。將上述分子作為治療腫瘤(包括MM)的潛在靶點，極大地引起了研究者們的興趣。抗BAFF抗體、TACI-Fc及BR3-Fc在自身免疫性疾病和B細胞惡性腫瘤中的作用仍需進一步臨床試驗評估；同時，破壞BCMA免疫球蛋白Fc段或BCMA抗體也被認為是一種控制惡性腫瘤的治療策略，但目前仍不可能完全治愈B細胞惡性腫瘤。有研究表明，BAFF與BCMA或TACI結合后，可激活不同信號通路，如NF-κB、p38 MAPK及JNK信號通路。盡管信號通路活化和BCMA表達在細胞存活與增殖中都有重要作用，但在MM細胞中兩者是否存在相互作用及其作用機制仍不清楚。

本試驗擬研究MM細胞中BCMA表達及JNK信號通路活化情況，初步探討JNK信號通路與BCMA表達間的相互關系，進一步明確MM細胞發生發展機制，為MM的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南通大學附屬醫院收治的MM患者18例，平均年齡為(60.0±10.0)歲。所有患者均符合MM診斷標準。患者主要特征為骨痛、疲乏、漿細胞浸潤、感染和腎功能受損，均排除類風濕關節炎(RA)、中樞神經系統疾病、糖尿病等疾病。健康對照者23例。收集外周血3 mL，采用Ficoll淋巴細胞分離液分離單核細胞(PBMCs)，-80 ℃保存備用。

1.2 儀器與試劑 采用人重組BAFF(rhBAFF，美國R&D公司)，JNK信號通路特異性抑制劑SP600125(美國Sigma公司)，BAFF抗體、BCMA抗體 (美國R﹠D公司)，兔抗ERK抗體、兔抗磷酸化ERK抗體、兔抗p38抗體、兔抗磷酸化p38 抗體、兔抗JNK 抗體、兔抗磷酸化JNK抗體(美國Cell Signal公司)，β-Actin抗體(美國SANTA CRUZ公司)，TRIzol(Invitrogen公司)，山羊抗兔IgG(H+L)，山羊抗鼠IgG(H+L)，BeyoECL Plus(超敏ECL化學發光試劑盒)，WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天)。

1.3 細胞培養 采用RPMI1640完全培養基[RPMI1640基礎培養基+10%胎牛血清(FBS)+1%青霉素、鏈霉素及谷氨酰胺]，37 ℃、5%CO2條件下培養人MM細胞株U266。2周后培養基中需補充1% 200 mmol/L谷氨酰胺。

1.4 熒光定量(QRT)-聚合酶鏈式反應(PCR) 用TRIzol 法提取細胞總RNA，并用紫外分光光度儀測定總RNA水平。分別取等量RNA以逆轉錄試劑盒逆轉合成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR 擴增。BAFF引物序列：上游引物5′-TGT CAC CGC GGG ACT GAA AAT CT-3′，下游引物5′-TGT CTG CAA TCA GTT GCA AGC AGT-3′；BAFF-R上游引物5′-CTT TCT GGG ACC AGG CTA ACC-3′，下游引物5′-TTC AAG GGC TGT CAA AGA TGG T-3′；BCMA上游引物5′-GCA TCA AGA GCA AAC CGA AGG-3′，下游引物5′-TCT ATC TCC GTA GCA CTC AAA GC-3′；TACI上游引物5′-GCT GAA GCT GAG TGC AGA TCA-3′，下游引物5′-CCC TCT TCT TGA GGA AGC AGG-3′。同時以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參照進行擴增。GAPDH上游引物5′-TGC TGT TCT GAC TGG AGT TG-3′，下游引物5′-GCT GTC TTG CTG CCT CAC-3′。反應終體積20 μL中，10 μL SYBR Green Ⅰ mix (Rox)，3 μL cDNA，上下游引物各0.5 μL 。反應條件：95 ℃預變性10 min，隨后95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 31 s，重復40個循環。

1.5 WST-1細胞增殖檢測 收集對數生長期U266細胞，調節細胞密度，加入96孔板，每孔加入約3 000個細胞，再加入一定體積干預物質，每孔補加培養基至100 μL。每孔加入10 μL WST溶液，培養2 h后，用酶標儀以450 nm(650 nm參考)波長測量各孔的吸光度值。每組設定3個復孔。重復試驗3次，取其均值。

1.6 Western Blot 分別提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白水平，根據標準曲線計算出蛋白水平。取50 μg 總蛋白進行150 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并在恒流300 mA下120 min將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉至PVDF膜。50 g/L的脫脂奶粉/TBST液封閉。一抗JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、BAFF、BCMA及β-actin抗體4 ℃孵育過夜。加二抗(山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG)，室溫孵育2 h，用增強化學發光(ECL) 進行顯影。

1.7 細胞轉染 轉染前1 d，收集對數生長期的細胞，以1×106/mL細胞密度接種于六孔板內，每孔接種2 mL。培養至細胞融合度為70%～80%。BCMA-SiRNA或非特異性SiRNA與轉染試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20 min。將轉染混合物以40 nmol/L水平加入到細胞懸液內，前后搖晃孔板，輕輕混勻。細胞于CO2培養箱中37 ℃溫育8 h后更換培養基，繼續培養48 h，再進行轉染后的其他檢測步驟。

2 結 果

2.1 BAFF及其受體在MM細胞株及MM患者細胞中的表達 收取MM患者及健康對照者PBMCs提取總RNA及總蛋白，QRT-PCR試驗結果，見表1。18例MM患者PBMCs中BAFF、BCMA的表達(1.51±0.24、1.21±0.15)顯著高于23例健康對照者(0.74±0.20、0.70±0.08)，Western Blot檢測總蛋白結果顯示MM患者PBMCs及MM細胞株U266細胞中BCMA的表達顯著高于健康對照者，見圖1。結果表明MM細胞中BAFF和BCMA均高表達，因此，筆者后續試驗著重于兩者異常表達對MM細胞的作用及其相互作用。

表1 PBMCs中BAFF及其受體的表達

注：與健康對照者比較，#P<0.05。

注：采用Western Blot，P為MM患者，N為健康對照者。

2.2 BAFF通過BCMA促進MM細胞生長 為進一步明確BAFF及BCMA對MM細胞生長的作用，筆者分別用rhBAFF和BCMA-SiRNA干預后行WST-1細胞增殖試驗，結果顯示：隨著rhBAFF水平的增加(50、 100、200、400 ng/mL)，U266細胞的增殖顯著增加，見圖2A。不同BCMA-SiRNA轉染U266細胞篩選出最有效的SiRNA(即Si-392)用于后續試驗，見圖2B。rhBAFF和Si-392共同干預U266細胞，WST-1細胞增殖試驗結果顯示，Si-392可抑制rhBAFF的促增殖作用，見圖2C。rhBAFF和Si-392干預后提取總蛋白，Western Blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達，結果顯示：rhBAFF能上調Bcl-2蛋白的表達，下調Bax蛋白的表達，而Si-392能抑制rhBAFF上述作用，見圖2D。結果表明，BAFF通過BCMA促進MM細胞生長，抑制細胞凋亡。

2.3 MM細胞中BAFF及BCMA參與的信號通路 有研究報道，MM細胞中NF-κB通路的活化介導了BAFF促存活、增殖、分化和轉移。筆者前期研究發現，rhBAFF可誘導NF-κB活化增加[6]。為研究MM細胞中rhBAFF對MAPK信號通路蛋白表達與活化情況的影響，rhBAFF干預后收集U266細胞提取總蛋白。Western Blot結果顯示，隨著rhBAFF水平增加，ERK、JNK、p38及活化蛋白p-JNK的表達上調，未見p-p38及p-ERK的表達，見圖3A。上述結果表明，MM細胞中有JNK信號通路的活化，且rhBAFF可誘導JNK信號通路的活化。rhBAFF和/或Si-392干預U266細胞后行Western Blot，結果顯示rhBAFF可上調p-JNK的表達，Si-392可下調p-JNK的表達，且Si-392可部分抑制rhBAFF對p-JNK的上調作用，如圖3B。上述結果表明，BAFF及BCMA均可誘導JNK信號通路的活化，且BAFF誘導JNK活化的作用具有BCMA依賴性。

注：A為WST-1細胞增殖試驗檢測不同水平rhBAFF對U266細胞增殖的影響；B為QRT-PCR篩選最有效的BCMA沉默基因；C為WST-1細胞增殖試驗檢測rhBAFF及si-392對U266細胞增殖的影響；D為Western Blot檢測rhBAFF及si-392對U266中凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的影響；*P<0.05。

圖3 BAFF通過BCMA誘導JNK信號通路的活化

注：A為Western Blot檢測不同水平SP600125對p-JNK蛋白表達的影響；B為QRT-PCR檢測SP600125對BCMA基因表達的影響；C為Western Blot檢測檢測SP600125對BCMA蛋白表達的影響；*P<0.05。

2.4 JNK信號通路調節BCMA的表達 不同水平的JNK信號通路抑制劑SP60015(10、20、40、80 μM)作用于U266細胞，48 h后提取總RNA和總蛋白。Western Blot結果顯示，隨著抑制劑SP60015水平的增加，p-JNK的表達逐漸下降，JNK通路活化顯著受抑制，見圖4A。QRT-PCR及Western Blot檢測BCMA表達，結果均顯示，隨著抑制劑SP60015水平的增加，BCMA的表達逐漸減低，見圖4B、4C。結果表明，JNK通路活化可調節BCMA表達，JNK通路活化與BCMA表達呈正相關。

3 討 論

MM是骨髓內漿細胞異常增生的一種惡性腫瘤，由于骨髓中有大量異常漿細胞增殖，引起溶骨性破壞，臨床主要表現為貧血、骨痛等[7]。盡管初始化療藥物對大多數MM患者有一定療效，但最后幾乎所有患者由于藥物耐受而復發。預計從2010年到2030年，MM復發患者將增長57%，故尋找有效治療措施成為未來醫學界的主要奮斗目標[8]。有文獻報道，BAFF可調控惡性B細胞的增殖，BAFF及其受體參與了MM的存活、分化與增殖，在MM的病理生理中發揮重要作用。也有研究發現，可溶性BCMA在骨髓瘤患者中高表達，其表達高低與患者疾病進展及預后具有相關性。除此之外，有報道稱BCMA可誘導霍奇金淋巴瘤細胞的存活與增殖[9]。上述所有結果表明，BAFF-BCMA軸在B細胞腫瘤的細胞生理中至關重要。

盡管臨床前試驗及早期臨床試驗表明，某些單克隆抗體可作為治療MM的潛在靶點[10-11]，但是否有明確臨床效果仍未見報道。故尋求對MM有效的新免疫學療法依然重要。在前期研究中，筆者發現MM患者PBMCs和U266細胞系中BAFF及BCMA高表達并促進細胞增殖。本研究結果顯示，rhBAFF可上調U266細胞的增殖和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，而Si-392沉默BCMA表達后，可抵消rhBAFF的上調作用，結果表明BAFF通過BCMA促進MM細胞的增殖。

BAFF可活化經典及非經典NF-κB通路、JNK信號通路等，上述通路的活化可促進MM細胞的存活與增殖[9,12]。BAFF與BCMA、TACI或BAFF-R的結合可活化經典及非經典NF-κB通路，進而上調抗凋亡蛋白表達，下調凋亡蛋白表達。本研究中，筆者采用U266細胞篩選通路活化蛋白表達，結果顯示p-JNK表達即MM細胞中有JNK信號通路活化。隨后，筆者經Western Blot驗證了JNK信號通路活化對MM細胞增殖的作用及對BCMA表達的影響，即JNK信號通路活化可促進MM細胞增殖，抑制JNK信號通路活化可下調BCMA的表達。筆者以rhBAFF及BCMA的Si-392干預U266細胞后，采用Western Blot檢測p-JNK的表達，結果顯示rhBAFF上調p-JNK的表達，Si-392可抑制rhBAFF對p-JNK的上調作用。上述結果表明BCMA參與了JNK信號通路的活化，BAFF通過BCMA活化JNK信號通路。由于JNK信號通路活化和BCMA表達都可促進MM細胞的存活與增殖，且彼此相互影響，所以筆者有理由認為，JNK信號通路活化和BCMA表達間可形成正反饋回路，共同促進MM細胞的存活與增殖。

本研究發現，在MM中有JNK信號通路活化和BCMA表達，且JNK信號通路活化可上調BCMA表達，沉默BCMA表達可抑制JNK信號通路活化。JNK信號通路活化和BCMA表達相互影響，共同促進MM細胞的存活與增殖。本研究初步探討了JNK信號通路、BCMA及MM3者間的關系，揭示了MM細胞中JNK信號通路活化和BCMA表達間存在正反饋回路，為MM的治療提供了1個新的免疫靶點。

[1]Comert M,Gunes AE,Sahin F,et al.Quality of life and supportive care in multiple myeloma[J].Turk J Haematol,2013,30(3):234-246.

[2]Andrews SW,Kabrah S,May JE,et al.Multiple myeloma:the bone marrow microenvironment and its relation to treatment[J].Br J Biomed Sci,2013,70(3):110-120.

[3]Terpos E,Christoulas D.Effects of proteasome inhibitors on bone cancer[J].Bonekey Rep,2013,14(2):395.

[4]Fragioudaki M,Boula A,Tsirakis G,et al.B cell-activating factor:its clinical significance in multiple myeloma patients[J].Ann Hematol,2012,91(9):1413-1418.

[5]Fragioudaki M,Tsirakis G,Pappa CA,et al.Serum BAFF levels are related to angiogenesis and prognosis in patients with multiple myeloma[J].Leuk Res,2012,36(8):1004-1008.

[6]Shen X,Zhu W,Zhang X,et al.A role of both NF- B pathways in expression and transcription regulation of BAFF-R gene in multiple myeloma cells[J].Mol Cell Biochem,2011,357(1/2):21-30.

[7]Garfall AL.Fraietta JA,Maus MV.Immunotherapy with Chimeric Antigen Receptors for Multiple Myeloma[J].Discov Med,2014,91(17):37-46.

[8]Orlowski RZ.Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma[J].Cancer Cell,2013,24(3):275-277.

[9]Hengeveld PJ,Kersten MJ.B-cell activating factor in the pathophysiology of multiple myeloma:a target for therapy[J].Blood Cancer J,2015,5(2):e282.

[10]Richardson PG,Lonial S,Jakubowiak AJ,et al.Monoclonal antibodies in the treatment of multiple myeloma[J].Br J Haematol,2011,154(6):745-754.

[11]Donk NW,Kamps S,Mutis T,et al.Monoclonal antibody-based therapy as a new treatment strategy in multiple myeloma[J].Leukemia,2012,26(2):199-213.

[12]Xu G,Shen XJ,Pu J,et al.BLyS expression and JNK activation May form a feedback loop to promote survival and proliferation of multiple myeloma cells[J].Cytokine,2012,60(2):505-513.

Interaction between JNK signal pathway activation and BCMA expression collectively promotes the survival of multiple myeloma cells

XUGuang1,BANYonghong1,JUShaoqing2,ZHUBaoli1△

(1.JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing,Jiangsu210028,China; 2.MedicalLaboratoryCenter,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China)

Objective To investigate the expression and role of B-cell activating factor(BAFF) and B-cell maturation antigen(BCMA) in multiple myeloma(MM) cells,expression and activation of JNK signal pathway and to explore the interaction between JNK signal pathway activation and BCMA expression.Methods The expression of BAFF and its receptor BCMA,TACI and BAFF-R in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) of MM patients and healthy controls were detected by the quantitative real-time fluorescence PCR(QRT-PCR).Western blot was adopted to detect the expression of BCMA protein and the expression and activation of signal pathway protein ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38 and p-p38.MM cell proliferation and survival were measured by WST-1 assay.Results The expression of BAFF and BCMA in PBMCs of MM patients was significantly higher than that of healthy controls.Recombinant human BAFF(rhBAFF) promoted the proliferation of MM cells,while Si-BCMA could restrain the proliferative effect of rhBAFF on MM cells.In addition to the expression of ERK,JNK,p38,p-JNK was also expressed in MM cell lines.Si-BCMA could down-regulate the expression of p-JNK,while the JNK pathway inhibitor could down-regulate the expression of p-JNK and BCMA.Conclusion BAFF promotes the proliferation of MM cells via BCMA.The interaction between JNK signal pathway activation and BCMA expression commonly promotes the proliferation and survival of MM cells.

multiple myeloma; B cell-activating factor; B-cell maturation antigen; JNK signal pathway

徐光，女，技師，主要從事免疫方面的研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.009

A

1673-4130(2016)22-3117-04

2016-03-21

2016-06-18)