人芽囊原蟲形態學的研究進展

韓呈武 綜述，曹興午 審校

(中日友好醫院檢驗科，北京 100029)

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人芽囊原蟲形態學的研究進展

韓呈武 綜述，曹興午△審校

(中日友好醫院檢驗科，北京 100029)

人芽囊原蟲； 形態學鑒定； 培養； 寄生蟲

人芽囊原蟲(B.h.)是一種常見的人與動物腸道寄生蟲。于1849年首次報告，1912年從人體糞便中發現，根據其形態特征歸屬于酵母菌，并命名為人體酵母菌，其后，在哺乳類、鳥類、爬蟲類、兩棲類及昆蟲類都得到檢出。B.h.一直被認為是一種對人體無害的酵母菌，1976年有學者進一步對形態特征進行了光鏡與電鏡區別。根據其性質、生理和形態體征發現，B.h.嚴格厭氧，采用培養細菌或真菌的培養基不能生長，營養類似原蟲，室溫培養3 d死亡，pH 7環境生長，無細胞壁，具有偽足和原蟲線粒體等特點[1]。1996年以后進行分子生物學的研究，人體分離蟲株間的遺傳性顯示了多形態特點。目前，確定B.h.分為9個遺傳子類型，另在鳥類、哺乳類同樣亦可檢出，確定其為人畜共患病原菌[2]。為提高B.h.檢出率，本研究重點就B.h.形態學鑒定、方法與B.h.病進行綜述。

英國PSI公司在緊密耦合霧化技術的基礎上對緊耦合環縫式噴嘴結構進行了結構優化和改進，使氣流的出口速度超過聲速，可在較小的霧化壓力下獲得高速氣流，在2.5 MPa壓力下，氣體速率可達到540 m/s，此外超聲緊密耦合霧化技術可以提高粉末的冷卻速度，效率高，成本低，且應用范圍廣，是氣霧化技術重要的發展方向之一，且具有工業實用意義，對于促進3D打印用金屬粉末的工業化生產制備有著重要的意義[7,11]。

1 流行病學與檢出率

B.h.世界均有報告，高發于熱帶和亞熱帶地區[3]。廣西省地處亞熱帶，氣候溫暖潮濕，是多種寄生蟲病流行的重要地區。近年研究表明，B.h.感染在廣西人群中較常見[4-5]。但是，臨床醫師對惡性腫瘤患者B.h.感染認識不足，易漏診或誤診，導致惡性腫瘤患者的病情加重[6]。

吉川尚男[2]認為：由于檢查方法不同(如直接鏡檢、染色檢查、培養檢查)，檢查對象和鑒定水平存在差異，各地區檢出率差異性較大。美國為22.9%，英國為6.9%(96/1 390)，日本采用糞便碘染色鏡檢+直接涂片檢查+姬姆薩染色檢查陽性率為0.47%(30/6 422)。其采用培養方法，提高陽性率為2.45%(50/2 037)，并強調反復多次檢查慢性腹瀉的患者糞便檢出率高。張峰等[7]介紹，我國有幾十個省市報道有B.h.感染。

筆者注意到20世紀70～90年代一直以B.h.無致病性處理。在日常糞便常規寄生蟲檢查中，以鐵蘇木素染色，油鏡觀察，檢出率為45.0%，曾強調腹瀉患者更為多見[8]，并指出一般鏡檢容易與白細胞混淆[9]。

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長期以來，B.h.生活史尚不清楚，造成對其形態和致病性不明確。近期研究認為，B.h.通過3種方式進行發育與繁殖：顆粒型方式、空泡型方式、阿米巴型方式。見圖1。如何使滋養體形成空泡型，顆粒型營二分裂繁殖及形成包囊型，至今不明[2]。 可從宿主糞便培養中看到，包囊型分化成空泡型與顆粒型。由于作為具有感染性質的包囊型在人體盲腸和大腸內形成與寄居，人工培養不能造成腸道微環境，故在培養基中看不到包囊型。包囊隨著糞便排出外界后，經口食入感染，在人體腸腔內脫囊，才能形成空泡型與顆粒型B.h.，而后，其再進行分裂、繁殖和增生，完成生活史[2]。因此，包囊型發育成為空泡型與顆粒型只有在宿主腸道內才可看到，體外人工培養不可能完成包囊型B.h.[2]。

2 生活史

全國人體重點寄生蟲病現狀調查SWOT分析(2015)認為[11]：寄生于人體且致病的腸道原蟲常見有溶組織內阿米巴、藍氏賈第鞭毛蟲和B.h.等，上述寄生蟲是引起人體腹瀉、腹痛的主要病原體。目前，B.h.在全世界依然被列為威脅人類健康的10種主要寄生蟲病之一，其感染潛在危害較大，且易與一般胃腸道感染相混淆，容易漏診或誤診，嚴重時可危及生命[11]。

培養基制作：用1 mol/L的NaOH調整蒸餾水pH 7.0～7.4，加至1 000 mL。放置120 ℃，高壓滅菌20 min，滅菌后備用，放入冰箱可保存一年以上。加入無菌馬血清，制作成液體培養基，放入冰箱可保存1個月以上。此外，可分裝在5～15 mL塑料管中滅菌后備用。培養基裝入培養容器70%容量即可。

近年胡纓等[10]對就診的 1 185 例慢性腹瀉患者進行糞便檢查，B.h.感染率為12.24%，其中有黏液膿血便患者感染率顯著高于其他類型腹瀉者(P<0.05)；不同性別、年齡腹瀉者間感染率差異無統計學意義(P>0.05)；農民感染率最高(為20.29%)。實驗室輔助檢查中，69.66%的感染患者中有血紅蛋白降低；80.69%的感染患者IgG、IgM、IgA均正常；86.90%的感染者 CD3+、CD4+表達水平降低，CD8+表達水平相對穩定，CD4+/CD8+比值下降。 結論認為，B.h.感染是慢性腹瀉的1個重要病原體，其致病作用不容忽視。

注：空泡型見于生活史的底部(通常在臨床標本中可以看到)；顆粒型的發育見于生活史圖的左側部分；阿米巴型見于生活史圖的右側部分。顆粒型與阿米巴型的蟲體均可以由空泡型(中心體)產生而來;增殖可通過二分裂(空泡型和顆粒型)、出芽(形成阿米巴型)、裂體生殖(中心體)和孢子形成(空泡型，少見)而發生。

3 形態學特征描述

染色液配制：90%乙醇170 mL；100%甲醇160 mL；醋酸20 mL；石炭酸20 mL；1%磷鎢酸12 mL。將上述試劑注入618 mL的蒸餾水中，混合均勻，加入氯碳混合劑(武藤化學和光純藥工業產品)5 g，混合后備用。

用染色序列對P進行著色,實際上是對m(2n+1)+2n-1條邊進行著色,而圖4中色集合的個數有個,根據上述染色算法,當k是奇數時,有當k是偶數時,有因此恒成立,此時求得最小的整數k滿足?。

注：中央有巨大空泡，核緊靠邊緣。

注：細胞呈泡狀結構，內含大量大小不一、功能不詳的顆粒，核靠近邊緣。

注：形態不規則，有偽足、核邊緣化，中央有空泡和顆粒。

4 顯微鏡不同倍率檢查與形態特征

4.1 低倍鏡檢查 筆者采用生理鹽水直接糞便涂片低倍顯微鏡觀察，B.h.為無色或淺黃色，圓形或卵圓形，大小不一，數量多時視野可呈“滿天星”點狀。內含1個巨大透明體，其周圍圍繞以極小細胞質，在細胞質內可看到有少數折光小體(顆粒)，遇到普通水或蒸餾水可以迅速破裂而消失[9]，見圖5(僅見蟲圖輪廓)。

圖5 患者糞便標本低倍觀察

4.2 高倍鏡檢查 在光鏡下(40×10)，生理鹽水涂片中B.h.為圓形、卵圓形，無運動現象，核及其他結構不易辯認，不易與其他腸道原蟲包囊區別；可見3類型：空泡型、顆粒型和阿米巴型。新鮮糞便標本立即涂片可觀察到直徑為5～50 μm的空泡型和顆粒型蟲體，見圖6。此外，還可檢出直徑為3～5 μm的包囊型蟲體，通常小型蟲體光鏡觀察比較困難。

注：培養的蟲體在中央均有液泡(CV)。具有圓形小顆粒為顆粒型(GF)；無顆粒者為空泡型(VF)[2]。

排出糞便后，放置4 h再進行糞便涂片時，空泡型與顆粒型蟲體不能維持原來形態，此為B.h.嚴格厭氧性質決定。蟲體排出后接觸空氣，會發生急劇變性和裂解，見圖7。變性的空泡型與顆粒型蟲體與原本不固定的阿米巴型蟲體很難區分。從糞便標本中檢出特殊的阿米巴型就比較困難[2]。

注：在蓋玻片周圍的蟲體，由于接觸空氣(氧氣)導致蟲體裂解，呈形態空化、溶解(A)。再延時后，可以完全變性，細胞膜呈纖維狀，其中央呈顆粒聚焦現象(B)[2]，完全溶解。

培養基放置冰箱冷藏，接種標本時，必須將培養基置于室溫事先預熱，將新鮮糞便培養放入培養基，用滅菌棒攪拌均勻。與放入糞便量有關，一般采用15 mL的塑料管，放入1 g糞便較適宜。如果采用微型管，一般在5～10 mg(3倍火柴頭大小)為宜。

4.3 油鏡檢查 B.h.低、高倍率顯微鏡顆粒型，不易與腸道內較小原蟲、哈門內阿米巴、脆弱雙核阿米巴等區別。用鐵蘇木素染色光鏡(100×10)觀察,B.h.形態多樣，可見空泡型、顆粒型、阿米巴型及二分裂型[1]。其中以空泡型多見,蟲體顯示出顯著囊壁，中央有清楚和染色較深的區域將核推向蟲體邊緣，核染成深藍色，多在3個以上[13]。見圖8、9。

圖8 鐵蘇木素染色光鏡(100×10)觀察B.h.空泡型，核邊緣化[13]

圖9 鐵蘇木素染色光鏡(100×10)觀察B.h.空泡型，核邊緣化[12]

4.4 瑞姬方法染色 空泡型蟲體，形態多樣化，中央空化，核邊緣化。見圖10。

圖10 瑞姬方法染色空泡型蟲體

4.5 電鏡觀察 何妮等[1]介紹：B.h.電鏡觀察可根據包囊有無纖維外衣將其分為纖維包囊型和包囊型2種。纖維包囊型能吸附細菌和其他包囊，導致異體宿主感染。2種包囊型內部結構大體相同。B.h.漿內含有粗面和滑面內質網、高爾基體、溶酶體、糖原顆粒等，細胞核內有異染色體，線粒體差異變化大，細胞膜有微吞飲功能，細胞外可能包被纖維外衣。在培養中發現，B.h.包囊形成過程中蛋白代謝增強，細胞核周圍及粗面內質網區域管溝樣機構增加[1]。

5 采用不同檢查方法與形態特征

對B.h.而言，檢查方法與檢出率密切相關，不同的染色方法有不同形態特征，學者曾進行的不同嘗試與經驗，現分別介紹如下。

5.1 碘染色方法 此為鑒定糞便阿米巴包囊經常采用的方法，取一滴碘液在載物片上，用牙簽采取糞便少許，涂成薄片，加蓋蓋玻片鏡檢，低倍鏡可以看到B.h.呈耀眼亮點，高倍鏡可看到B.h.當中的空泡，此可與其他包囊鑒別，見圖11。如果蟲體較少、糞便標本排出時間過長或標本保存不好就難以檢出[2]。

注：A為結腸阿米巴包囊(下面)和多態性B.h.的顆粒型蟲體(上面)。B為可看到二分裂蟲體的標本。無論哪一種蟲體，都可以染成黃色，在細胞質周圍可見顆粒狀的線粒體樣物質和細胞核(B.h.)特征[2]。

5.2 Cone染色液方法[2]本方法優點為直接檢查與固定標本同時進行。將糞便標本涂成薄片，在涂片標本處于半干狀態，滴加染色液(見配方)，染色30 min，用蒸餾水輕輕沖洗，加蓋片鏡檢。染色適宜度為酵母菌等濃染。B.h.呈深藍色或黑色，此為染色液特異性的結果，見圖12a。鏡檢發現染色不理想時，仍然可重新再染1次。如果想永久保存標本，可采取蒸餾水沖洗后干燥，或用乙醇梯度脫水，用二甲苯透明后，再用光學樹脂封片。在此染色片中，油鏡下可看到蟲體周圍有一圈空白區(此為B.h.周圍1層纖維狀結構不被染色而形成的空白區)，這可與其他原蟲進行鑒別[2]，見圖12b。

吉川尚男[2]報告，目前共識有3類型B.h.：空泡型、顆粒型和阿米巴型?？张菪团c顆粒型的不同之處在于蟲體中心部位有無液泡，空泡型蟲體內所呈液泡為無構造和類似細胞液泡樣的均勻物質，而顆粒型則可以看到蟲體中心部位有顆粒樣物質存在，此為區別兩者依據[2]。見圖2、3。阿米巴型最顯著特點為形態不規則，見圖4。其有偽足和偽足運動，但運動相當緩慢，細胞核內含有空泡和顆粒[1]。顆粒型蟲體也能以二分裂方式繁殖[13]。何妮等[1]描述，空泡型直徑3～64 μm，大小差異懸殊，折光性強，蟲體透明，活體時細胞核不可見，細胞內有1個極大空泡結構。1990年研究報告B.h.還存在包囊型，直徑為2～5 μm，囊壁厚。不同來源的宿主其包囊形態不同。

注：A為B.h.濃染時呈深藍色甚至黑色，但看不到內部構造；B為淺染色時，可以看到中央的空泡和顆粒狀的細胞質，在蟲體周圍呈1個輪廓的“空圈”，可為鑒別特征。

5.3 MIF固定染色方法 適用于糞便中原蟲及蠕蟲蟲卵的固定、染色和標本保存，原蟲與蟲卵標本可長期保存。但B.h.不期望長期保存，只是短時間盡可能將標本處理，僅存留一部分標本作為長期保存備以后使用。使用甲醛固定的標本不能保持其原來的圓形形態，空泡型與顆粒型會形成多種多樣形態，見圖13。

注：B.h.形態不固定，中央空泡染色不均勻，在周圍細胞質內有線粒體樣結構和核，此點為鑒定特征[2，14]。

5.4 培養方法[2]以下介紹的方法為簡單且檢出率高的方法，之后還可進行遺傳學檢查，特別適用于DNA測定，很有實用價值。雖然已經報道多種培養基方法，但以液體培養基更為簡單方便。液體培養基組成：氯化鈉8.5 g；氯化鈣0.33 g；氯化鉀0.3 g；天門冬酰胺0.5 g。

大姐來淮南辦事，晚上在我家睡一覺，隔天早上回合肥。妻子問大姐，你先看電視，還是先洗澡？大姐跑一天，顯出一副疲倦的樣子。大姐說，我先歇一歇。我家住兩室一廳，我和妻子睡大臥室，擺一張大床，擺一組大柜；閨女睡小臥室，擺一張小床，擺一排書柜，書房兼臥室。大姐在我家過夜，她和妻子睡臥室大床，我睡客廳沙發上。妻子說她小時候就是跟大姐睡一張床，直到大姐下放去農村。妻子和大姐一邊看電視一邊說閑話，一說就說到皮膚病上面。大姐說，我勸你還是早一天去省立醫院看。妻子說，好、好、好，哪一天我休班就去你家。兩集電視劇看下來，時間到十點多鐘。妻子去臥室拿鋪蓋，準備在沙發上為我臨時鋪一張床。

空泡型與顆粒型不同點在于依細胞中心位置的液泡，空泡型呈均勻無結構，顆粒型則具有細小顆粒物質。在高倍光鏡下僅從中央液泡就可區分兩者形態差異，但電鏡觀察并不顯著[2]。

放入37 ℃溫箱培養，2～5 d，每天以滅菌吸管，吸取管底沉淀物表面，放載物片，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下進行觀察?？梢夿.h.繁殖的蟲體。見圖14、15。由于糞便內細菌繁殖，培養管內產生壓力，培養管可能發生自然脫落現象。當培養管蓋脫落時，內容物可能噴出，污染溫箱或環境。另外，培養蟲體在2 d急劇繁殖，消耗營養多，需要在次日轉種1次新培養基，保持繼代培養。培養基中渣滓較少時，進行DNA提取為宜[2]。

本文以《明史》中的《宰輔 年表》［2］（卷109、110，宰輔年表一、二）為主要研究對象。注意到其中存在錯誤，學界已有人進行了訂正，例如胡丹的《〈明史·宰輔年表〉校正〉》［3］。本研究結合《明史》中的其他內容及《明實錄》等進行了?？?。

注：可以看到呈圓形大小不等的蟲體，也可觀察到多形態的阿米巴型蟲體[2]。

注：能清楚看到多核蟲體，2個核的端極都以對角線形式存在，形成“雙眼”狀態[2]。

5.5 3種方法聯合檢查觀察 該方法為阿米巴原蟲經典染色方法[7]，眾多教科書的阿米巴原蟲圖譜大都依此法染色。1948～1963年，筆者在協和醫院寄生蟲室對糞便寄生蟲常規的檢查中，每例患者標本均采用糞便直接涂片、碘染色、硫酸鋅漂浮法3種方法聯合顯微鏡檢查，凡遇到原蟲且即便是可疑時，必須進行鐵蘇木素染色方法制作標本，經油鏡檢查與鑒定[15-16]，共完成115 834例寄生蟲感染患者的檢查與統計[17]，并獲得B.h.檢出率45%的統計結果[9]?？梢娝脵z查方法決定檢出率高低。

6 臨床表現

B.h.是近20 年來被人們所重視與腹瀉相關的人體寄生蟲，其癥狀無特殊表現，易與腸道一般感染相混淆。一旦糞便檢出B.h.即可確診。對于部分慢性腹瀉而病因不明的患者應注意該蟲感染的可能[10]。膿血便原因分析可能是紅細胞能為B.h.提供營養物質，故而B.h.感染更易存在于黏液膿血便中；再者慢性腹瀉治療不當易引起腸黏膜損傷和腸道功能紊亂，甚至出現黏液膿血便，上述情況下B.h.更容易侵入機體。

胡纓等[6]報道，在對683例惡性腫瘤住院患者進行B.h.病原學檢查中發現，受感染者112例(16.40%)，其中黏液膿血便組感染率顯著高于其他類型糞便組(P<0.05)；不同性別、年齡間感染率差異無統計學意義(P>0.05)；在不同治療組中，化療組感染率最高，為26.40%；在不同腫瘤類別組中，消化系統組的感染率最高，為28.51%；低清蛋白組感染率顯著高于清蛋白健康組(P<0.05)；免疫功能低下組感染率顯著高于免疫功能健康組(P<0.05)。B.h.大量繁殖導致感染者不同程度的腸道病變，其臨床表現無特異性；大部分感染者主要表現為腹痛、腹瀉、腹脹、厭食、惡心、嘔吐等癥狀；部分感染者可出現乏力、發熱、全身不適等，易與一般炎性反應相混淆；個別重癥患者可導致嚴重腹瀉、低蛋白血癥、全身水腫等，甚至危及生命[18-19]。

數字化轉型像工業革命一樣具有顛覆性，除了領導層要從思想上高度重視并大力支持外，還需要專業化的高水平人才進行總體推進，且全員配合參與。而傳統的制造業一般生產任務繁重，參與數字化建設的工作人員只能在不耽誤生產任務的前提下兼顧完成，這必然導致員工重視程度不足，甚至缺乏主動參與的意愿。

7 治 療

治療本病多采用甲硝唑(滅敵靈)，每次口服250 mg，每日3次，5～10 d為1個療程，可使糞便陰性。部分復發或治療無效，可加大劑量為750 mg。對于不同的蟲株，敏感性可能不同。對于耐藥患者，可采用復方磺胺甲噁唑、痢特靈、雙磺喹啉、黃連素或鴉膽子治療[1]。黃道超等[20]認為，甲硝唑療效好、不良反應小，廉價安全，使用方便，且具有抗厭氧菌作用，可被作為治療人和動物阿米巴病的首選藥物。

8 小 結

有學者指出，新現和再現感染性疾病已經成為影響人民健康重要的公共衛生問題。作為從事醫學教育、研究、臨床和預防的衛生工作者，應積極應對，不斷學習，充實和擴大專業知識面，同時還要擔負起宣傳、教育的職責，提高全體民眾的衛生防病意識[16]。

筆者強調，檢驗醫學在臨床及衛生領域起到舉足輕重的作用，是臨床醫學不可缺的組成部分。增加新現和再現寄生蟲的認識，提高寄生蟲感染認識和寄生蟲形態鑒別與檢出率是當務之急，刻不容緩。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.028

A

1673-4130(2016)22-3168-05

2016-04-01

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