T-SPOT. TB聯合血漿細胞因子檢測在活動性結核病診斷中的應用

陸小艷,楊 藝,楊 丹

(廣西壯族自治區百色市人民醫院,1. 感染性疾病科; 2. 呼吸內科,廣西 百色,533000)

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T-SPOT. TB聯合血漿細胞因子檢測在活動性結核病診斷中的應用

陸小艷1,楊 藝2,楊 丹1

(廣西壯族自治區百色市人民醫院,1. 感染性疾病科; 2. 呼吸內科,廣西 百色,533000)

目的 探討結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT. TB)聯合血漿細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-10(IL-10)檢測在結核病診斷中的作用。方法 隨機選取30例活動性結核病患者為A組,20例非活動性結核病患者為B組,30例健康體檢者為C組。各組分別行外周血T-SPOT. TB檢測，并采用ELISA法檢測血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。比較A、B組T-SPOT. TB陽性患者各孔斑點數；比較3組血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10濃度。通過繪制ROC曲線，對T-SPOT. TB試驗、血漿細胞因子水平在鑒別活動性與非活動性結核中的價值進行分析。結果 當T-SPOT. TB結果為陽性時,A組患者B孔斑點數明顯多于B組，得出ROC曲線下面積AUC是0.689(P<0.05)，為有效診斷指標。A、B組的IFN-γ、IL-10水平存在統計學差異，均為有效診斷指標(P<0.05或P<0.01)。結論 T-SPOT. TB聯合血漿IFN-γ、IL-10濃度檢測對判斷結核是否具有活動性有較高價值。

結核; IFN-γ; IL-2; IL-4; IL-10; 結核感染T細胞斑點試驗; 診斷

結核病是致病菌為結核分歧桿菌的慢性傳染性疾病，全球每年約有150萬人因結核病而死亡，中國結核病每年患病人數高居全球第二。目前，對肺結核病的診斷仍是醫療界面臨的重要挑戰。結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT. TB)在結核病的診斷方面具有較高的敏感性及特異性，但在區分結核活動性與否方面尚不理想，而臨床上對于活動性結核病與非活動性結核病的治療措施截然不同，對兩者的鑒別診斷亦尤為重要。研究[1]表明，當機體感染結核分歧桿菌后大多數處于潛伏感染狀態，當某些原因引起機體發生免疫功能紊亂時，感染可再活化，即發生活動性結核病。可見，機體的免疫狀態與結核病的活動性密切相關。有研究[2]認為，在結核病的不同狀態，血漿中某些細胞因子水平可發生不同程度的變化，增加檢測的不穩定性。本研究分別選取了細胞免疫與體液免疫相關細胞因子作為檢測指標，探討其在結核病診斷中的作用，尤其是活動性結核病與非活動性結核病的鑒別診斷，進一步了解抗結核的免疫機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年10月—2015年12月百色市人民醫院住院的30例活動性結核病患者為A組,20例非活動性結核病患者為B組。2組均經細菌學或組織學檢查并經臨床診斷證實。排除患有嚴重肝腎疾患、自身免疫性疾病、HIV感染、妊娠、近期使用過免疫抑制類藥物的患者。A組男22例，女8例；年齡19～78歲，平均(55.1±2.6)歲；其中包括活動性肺結核18例，腸結核2例，結核性心包炎2例，結核性腦膜炎2例，結核性腹膜炎2例，結核性胸膜炎1例，結核性胸膜炎合并肺結核2例，結核性心包炎合并胸膜炎1例。B組男12例，女8例；年齡22～80歲，平均(54.9±2.5)歲；其中包括陳舊性肺結核病15例，陳舊性結核性胸膜炎1例，結核潛伏感染4例。另隨機選取同期健康體檢的健康者30例為C組，其中男16例，女14例；年齡19～80歲，平均(54.8±2.9)歲。3組一般資料比較無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT. TB試驗方法：各組入院后分別行外周血T-SPOT. TB檢測。真空肝素鈉抗凝管采集外周靜脈血5 mL,常溫靜置2 h后送檢。T-SPOT. TB試劑盒購自上海復星高科技有限公司，實驗步驟嚴格按照產品說明書逐步進行。試驗結束后，光鏡下觀察試驗結果，進行斑點計數。

1.2.2 血漿細胞因子檢測方法: A、B組入院后均行血漿細胞因子檢測,C組與門診行檢測。真空肝素鈉抗凝管采集外周靜脈血5 mL,常溫靜置2 h后3 000 r/min離心10 min,收集血漿,ELISA法檢測血漿中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。ELISA試劑盒購自R&D公司。

1.3 觀察指標

比較A、B組T-SPOT. TB陽性患者各孔斑點數；比較3組血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10濃度。通過繪制ROC曲線，對T-SPOT. TB試驗、血漿細胞因子水平在鑒別活動性與非活動性結核中的價值進行分析。

若斑點計數為以下情況則判斷為陽性: ① 當陰性對照孔斑點數<6,A、B孔斑點數與陰性對照孔斑點數之差≥6時; ② 當10>陰性對照孔斑點數≥6時，如果A或B孔斑點數≥陰性孔斑點數×2。當達不到上述標準，且陽性對照孔斑點數≥20,判斷為陰性，表明患者體內不具針對MTB的效應T淋巴細胞。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 T-SPOT. TB試驗結果

A組中T-SPOT. TB陽性28例，陰性2例; B組中T-SPOT. TB陽性19例，陰性1例。C組T-SPOT. TB均為陰性。A組T-SPOT. TB陽性患者A孔斑點數1～205個，平均24.01個; B孔斑點數1～390個，平均75.51個; A、B孔斑點數之和為11～563個，平均112.5個。B組T-SPOT. TB陽性患者A孔斑點數1～163個，平均19個; B孔斑點數1～238個，平均26.01個; A、B孔斑點數之和為8～395個，平均50.51個。

圖1 2組T-SPOT.TB陽性患者A孔斑點數

圖2 2組T-SPOT.TB陽性患者B孔斑點數

圖3 2組T-SPOT.TB陽性患者A+B孔斑點數

采用GraphPad Prism 5 軟件對2組T-SPOT. TB陽性患者A、B孔斑點數進行散點圖繪制，統計學分析顯示A、B組T-SPOT. TB陽性患者A孔斑點數比較無顯著差異(P>0.05),如圖1-1; A組T-SPOT. TB陽性患者B孔斑點數明顯多于B組T-SPOT. TB陽性患者，差異有統計學意義(P<0.05),如圖1-2; 2組T-SPOT. TB陽性患者A+B孔斑點數之和比較無顯著差異(P>0.05),見圖1、2、3。

2.2 各組血漿細胞因子水平比較

各組血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10存在不同程度的差異。A組IFN-γ、IL-10水平明顯高于B、C組; A、B組IL-2水平明顯低于C組,IL-4水平明顯高于C組; B組IL-10水平明顯高于C組；以上組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組血漿細胞因子水平比較 pg/mL

2.3 T-SPOT. TB試驗、血漿細胞因子水平對活動性與非活動性結核的診斷價值

2.3.1 T-SPOT. TB試驗：當T-SPOT. TB結果為陽性時，A組患者B孔斑點數明顯多于B組。進一步進行ROC曲線分析，得出ROC曲線下面積(AUC)=0.689(P<0.05),為有效診斷指標。B孔斑點數對活動性與非活動性結核診斷的靈敏度為50.0%,特異度為88.5%,陽性似然比為4.67,陰性似然比為0.65。

2.3.2 血漿細胞因子水平：A組和B組的IFN-γ、IL-10水平存在顯著差異。進一步進行血漿IFN-γ濃度ROC曲線分析，得出AUC=0.925(P<0.01)，為有效診斷指標，對活動性與非活動性結核的鑒別，靈敏度為93.5%,特異度為86.0%,陽性似然比為6.22,陰性似然比為0.06。進一步進行血漿IL-10濃度ROC 曲線分析，得出AUC=0.891(P<0.01),為有效診斷指標，對活動性與非活動性結核的鑒別，靈敏度為93.6%,特異度為90.0%,陽性似然比為9.32,陰性似然比為0.06。

3 討 論

人體感染結核分歧桿菌后的發病與結核分歧桿菌的數量、毒力、機體免疫力等因素密切相關。大部分人感染結核分歧桿菌后處于潛伏狀態，此時，機體所感染的結核分歧桿菌在體內以靜止形式存在。當機體由于某些原因發生免疫力下降時，結核桿菌可能由靜止狀態轉化為活化狀態，此時潛伏感染轉變為活動性結核病[3-4]。機體抗結核免疫反應主要依賴巨噬細胞參與的細胞免疫，整個過程受多種細胞因子調節。Th1型細胞因子能夠增加巨噬細胞抗菌活性，有利于對結核病的控制[5]; Th2型細胞因子可降低巨噬細胞的抗菌活性，促進結核病的發展[6]。Th1/Th2的動態平衡決定了結核病的發生發展。

本研究選取了IFN-γ和IL-2(Th1型細胞因子)、IL-4和IL-10(Th2型細胞因子)作為研究指標。結果顯示，A組(活動性結核病患者)血漿IFN-γ、IL-10濃度明顯高于B組(非活動性結核病患者)和C組(健康體檢者)，這與相關文獻[7-8]報道一致?？梢?，機體感染結核分歧桿菌后,Th1型細胞免疫反應增強,T淋巴細胞產生IFN-γ水平增加。B組與C組間比較，血漿IFN-γ水平未見明顯差異，分析可能是由于非活動性結核病患者中大部分為陳舊性結核病患者的原因。IFN-γ能夠促進巨噬細胞活化，增加其抗原提呈作用，在控制結核感染中發揮重要作用[9]。本研究還發現，活動性結核病患者血漿中IL-10水平明顯高于非活動性結核病患者。說明活動性結核病換成存在明顯的免疫紊亂現象,Th1/Th2細胞因子失衡明顯。IL-10能夠抑制促炎因子的產生，通過對抗原提呈細胞活性的抑制發揮阻止T淋巴細胞活化的作用[10]。本研究通過對A、B組患者血漿IFN-γ、IL-10濃度進行ROC曲線分析，得出IFN-γ曲線下面積AUC=0.925,IL-10曲線下面積AUC=0.891,可見2種細胞因子在活動性與非活動性結核病的鑒別診斷中均具有較高價值，其中IL-10的陽性似然比明顯高于IFN-γ,可見IL-10更有助于對活動性結核病的診斷。

T-SPOT. TB試驗在結核病的診斷方面具有較高的特異性，且不受機體免疫狀態影響。Suzukawa[11]等在對T-SPOT. TB試驗相關文獻進行的Meta分析中報道,T-SPOT. TB對結核病的診斷綜合靈敏度為90%,特異度為93%。Donnachie等[12]在研究中稱,T-SPOT. TB對活動性結核病的診斷靈敏度是92.1%,特異度是82.5%。在T-SPOT. TB試驗中，每個斑點代表一個致敏的T淋巴細胞，斑點數目的增加也就反應了結核病的活動性。本研究中，活動性結核病患者與非活動性結核病患者的A孔斑點數、A孔與B孔斑點總數無明顯差異，而活動性結核病患者B孔斑點數明顯高于非活動性結核病患者，這與其他報道相一致[13-15]。通過對各組B孔斑點數進行ROC曲線分析,AUC=0.689,靈敏度為50.0%,特異度為88.5%?？梢奣-SPOT. TB試驗B孔斑點數雖為有效診斷指標，但診斷價值較低。

綜上所述,Th1/Th2細胞因子動態失衡在結核病的發生發展中發揮重要作用; T-SPOT. TB聯合血漿ELISA 的IFN-γ、IL-10濃度檢測在結核病的診斷中具有較高價值?；颊呷朐汉罂上刃蠺-SPOT. TB檢測，結果呈陽性時，進一步進行IFN-γ、IL-10濃度測定，以區分結核病的活動性，指導治療。

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Value of T-SPOT. TB combined with plasma cytokines in diagnosis of active tuberculosis

LU Xiaoyan1,YANG Yi2,YANG Dan1

(1.DepartmentofInfectiousDiseases; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,People′sHospitalofBaise,Baise,Guangxi,533000)

Objective To explore the value of T-SPOT. TB combined with interferon (IFN)-γ,interleukin (IL)-2,IL-4,IL-10 in diagnosis of tuberculosis (TB). Methods Thirty patients with active TB were designed as group A,20 patients with inactive TB were designed as group B,and 30 healthy examined people were designed as group C. Each group was conducted with peripheral blood T-SPOT. TB test,and the levels of plasma IFN-γ,IL-2,IL-4,and IL-10 were detected by ELISA method. The number of each hole SPOT of T-SPOT. TB-positive patients were compared between group A and group B,and the levels of plasma IFN-γ,IL-2,IL-4,and IL-10 were compared among three groups. Receiver operating characteristic (ROC) curve was drawn for assessing the value of T-SPOT. TB test and plasma cytokines in the differential diagnosis of active TB and inactive TB. Results When T-SPOT. TB result was positive,the number of B hole SPOT of T-SPOT was obviously higher in group A than group B,and the area under the ROC curve (AUC) was 0.689 (P<0.05),which indicating it was a effective diagnostic index. There were significant differences between group A and group B in the levels of IFN-γ and IL-10 (P<0.05 orP<0.01). Conclusion T-SPOT. TB combined with the detection of plasma IFN-γ and IL-10 concentration has a high diagnostic value in the assessment of whether TB is active or not.

tuberculosis; IFN-γ; IL-2; IL-4; IL-10; T-SPOT. TB test; diagnosis

2016-01-06

中國高校醫學期刊臨床專項資金(11527840)

R 825.2

A

1672-2353(2016)21-041-04

10.7619/jcmp.201621013